Сделай Сам Свою Работу на 5

Присоединение активного хроматина к ядерному матриксу

Внутри ядра репликативные ферменты должны каким-то образом найти сайты для инициации синтеза ДНК: транскрипционные факторы и полимеразы должны найти свои промоторы и энхансеры; факторы процессинга РНК должны найти сайты для сплайсинга РНК, а мРНК должна успешно найти поры, через которые она уйдет из ядра. Это слишком сложная задача для молекул в растворе. Нам пришлось бы предположить, что различные факторы, участвующие в транскрипции, плавают в ядерном соке, сталкиваясь случайно с ДНК. Молекулы РНК, образованные таким образом, будут затем подвергаться сплайсингу и сталкиваться в ядре до тех пор, пока не найдут ядерные поры, через которые покинут ядро.

Альтернативная модель предполагает, что РНК транскрибируется на твердом субстрате, где собраны вместе все ферменты, необходимые для транскрипции, процессинга и транспорта. Для таких представлений имеются прецеденты. Подобным упорядоченным агрегатом является цепь транспорта электронов в митохондриях, и давно известно, что ДНК-синтезирующие ферменты бактерий собраны на внутренней поверхности клеточной мембраны. В таком случае можно поставить следующие вопросы: существует ли ядерный ретикулум, где могли бы находиться подобные ферменты? Если такой матрикс существует, локализованы ли на нем активно

Рис. 12.29. Участок ядерного матрикса (слева)и окружающая цитоплазма (электронная микрофотография: х 47 000). Хорошо видны филаменты цитоскелета. Ядра выделяли из фибробластов мыши, экстрагировали детергентом для удаления липидов и затем обрабатывали ДНКазой I. (Из Сарсо et al., 1982; фотография с любезного разрешения S. Penman.)

 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

168_______________ ГЛАВА 12_____________________________________________________________________________

Рис.12.30. Саузерн-блотт, демонстрирующий фрагменты ДНК,защищенные ядерным матриксом, а также фрагменты, которые высвобождались из ядер после обработки рестриктазой EcoRI. ДНК, высвобождаемую обработкой EcoRI, фракционировали с помощью электрофореза одновременно с ДНК, выделенной из ядерного матрикса и не солюбилизировавшейся при обработке EcoRI, a также с общей клеточной ДНК из яйцевода курицы, стимулированного эстрогеном, ДНК переносили блоттингом на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с радиоактивными рестрикционными фрагментами из генов овальбумина и ß-глобина. Глобиновый ген не связывался с матриксом, а овальбуминовый ген присоединялся к фракции матрикса. (Из Ciejek et al., 1983;фотография с любезного разрешения В W. O’Malley. )

транскрибируемые гены? Если такой матрикс существует, находятся ли на нем РНК-синтезирующие ферменты?



Ядерный матрикс можно выделить путем суспендирования ядер в детергентах и гидролиза большей части ДНК с помощью ДНКаз (Berezney, Coffey, 1977; Сарсо et al., 1982). На электронной микрофотографии подобных комплексов выявляется сеть белков, которая пронизывает ядро и присоединяется на ядерной оболочке к цитоскелету (рис. 12.29). Такой матрикс наблюдали во всех эукариотических ядрах, исследованных до настоящего времени (Nelson et al., 1986).

При выделении матрикса данным методом ДНКаза удаляет до 98% ДНК.Содержит ли ДНК, которая остается связанной с матриксом (и, вероятно, защищенная от ДНКаз благодаря прочной связи с ним), активно транскрибируемые гены? Мы располагаем данными, что это и в самом деле так, по крайней мере для некоторых генов. Было показано, что ген овальбумина связан предпочтительно с ядерным матриксом в клетках яйцевода, но не в клетках печени или эритроцитах курицы (Robinson et al., 1982). При этом с ядерным матриксом клеток яйцевода, не были ассоциированы глобиновые гены. Другая группа исследователей подтвердила и развила эти наблюдения (Ciejek et al., 1983), показав, что вся индуцируемая гормоном единица транскрипции

Рис. 12.31. Расположение активного хроматина на периферии ядра и вдоль каналов. Ядра эритроцитов обрабатывали ДНКазой I,которая, как полагают,создает разрывы в участках хроматина, активных в транскрипции. Такие разрывы репарируются в ядрах с помощью ник-трансляции в присутствии меченых нуклеотидов, которые можно визуализовать по флуоресценции. Эти меченые нуклеотиды обнаруживаются на периферии ядра и вдоль структур, идущих от ядерной оболочки внутрь ядра. (Из Hutchinson, Weintraub, 1985; фотография с любезного разрешения N. Hutchinson.)

(включающая ген овальбумина и два соседних гена X и Y) связана с ядерным матриксом (рис. 12.30). Других генов, ассоциированных с матриксом, не было среди исследованных 100 000 пар оснований ДНК. Когда у животных удаляли эстгроген, исчезало специфическое присоединение этих генов к ядерному матриксу. Оказалось, что эти гены связаны с ядерным матриксом, только когда они активированы.

В 1985 г. Хатчинсон и Вайнтрауб (Hutchinson, Weintraub, 1985) обнаружили, что сайты, чувствительные к ДНКазе I, распределяются по ядру неравномерно. Эти авторы обрабатывали ядра ДНКазой I и затем, не разрушая ядер, проводили в них реакцию ник-трансляции. При этом меченая ДНК должна представлять только активно транскрибируемые (т.е. чувствительные к ДНКазе I) гены. Результаты этого опыта (рис. 12.31) показали, что ДНК, чувствительная к ДНКазе I, располагается на периферии ядер и вдоль каналов или волокон, которые присоединены к ядерной оболочке. В этом случае активные гены, вероятно, специфически ассоциированы с ядерным матриксом.

Третья группа данных, свидетельствующих об участии ядерного матрикса в транскрипции, включает наблюдения, что большая часть (в некоторых сообщениях 95%) новосинтезированной РНК оказывается присоединенной к ядерному матриксу (Miller et al., 1976; Herman et al., 1978; Mariman et al., 1982; van Eekelen, van Venrooij, 1981). Эта связь, по-видимому, осуществляется при участии особого белка ядерного матрикса. С учетом того, что активные


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ________________________ 169


Рис. 12.32. Суперспирализация ДНК в ходе транскрипции. Топоизомераза II связывает друг с другом два участка ДНК и индуцирует суперспирализацию путем временного разрыва и последующего воссоединения цепей ДНК. В результате упругого напряжения участок двойной спирали разделяется на две цепи, что позволяет РНК-полимеразе (предположительно и другим транс-регуляторным белкам) инициировать транскрипцию. Сайты связывания топоизомеразы обнаружены в ДНК, ассоциированной с матриксом (Cockerill, Garrard, 1986). (По Darnell et al., 1986.)

гены, РНК-полимераза и новосинтезированные транскрипты оказываются связанными с ядерным матриксом, было высказано предположение (Jackson, Cook, 1985), что транскрипция не осуществляется мобильной полимеразой, передвигающейся вдоль гена. По представлениям этих исследователей, вероятнее, что РНК-полимераза прикреплена к ядерному матриксу, а ДНК протягивается через нее.



©2015- 2019 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.