Сделай Сам Свою Работу на 5

Тканеспецифические энхансеры

Помимо энхансеров, описанных в предыдущем разделе, обнаружены также тканеспецифические энхансеры, подобные энхансеру гена тяжелой цепи иммуноглобулина. В поджелудочной железе гены экзокринных белков (химотрипсина, амилазы и трипсина) имеют энхансеры, отличающиеся от энхансеров эндокринного белка инсулина. Энхансеры обоих типов лежат в 5'-фланкирующих последовательностях соответствующих генов. Эти фланкирующие области были помещены на ген бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы – ген, ферментный продукт которого не обнаруживается в клетках млекопитающих (Walker et al., 1983). Затем эти гибридные гены трансфицировали в: а) клетки яичника; б) клеточную линию, секретирующую инсулин; в) линию экзокринных клеток и определяли активность маркерного фермента в клетках каждого из этих типов. Как показано на рис. 12.10. ни одна из энхансерных последовательностей не индуцировала образование фермента в клетках яичника. Однако в клетке, секретирующей инсулин, 5’-фланкирующая область инсулинового гена позволяла экспрессироваться гену хлорамфениколацетилтрансферазы, а 5’-фланкирующая об-


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ_____________________________ 147

 

Рис. 12.10. Тканевая специфичность энхансеров генов поджелудочной железы. 5'-фланкирующие участки гена инсулина (I) и гена химотрипсина (С) были встроены по отдельности за геном бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). В качестве положительного контроля за геном CAT был помещен также энхансер вируса саркомы Рауса (V). который функционирует, по-видимому, в клетках всех типов. Три полученных клона были трансфицированы в клетки трех типов, после чего в клеточных лизатах определяли активность CAT. На вставках показаны типичные радиоавтограммы измерений активности CAT с помощью хроматографии, при которой радиоактивный хлорамфеникол (субстрат для реакции, катализируемой CAT) мог быть отделен от моноацетата хлорамфеникола (продукта реакции, катализируемой CAT). (По Walker et al., 1983.)

 



ласть гена химотрипсина не давала такой возможности. Напротив, когда клоны вводили в линию экзокринных панкреатических клеток, 5-фланкирующая последовательность для химотрипсина позволяла экспрессироваться гену хлорамфениколацетилтрансферазы, а инсулиновый энхансер не позволял. Таким образом, экспрессия генов в экзокринных и эндокринных клетках поджелудочной железы контролируется, очевидно, различными энхансерами.

Нет ничего необычного в том, что один и тот же белок синтезируется в клетках не одного, а нескольких типов. Этосправедливо для желточного белка, который продуцируется у зрелых самок дрозофилы. Два гена этого желточного белка – ур1 и ур2 – лежат по соседству, но транскрибируются в противоположных направлениях (рис. 12.11). Оба гена транскрибируются в яичнике и жировых телах. Эти гены могут быть отделены друг от друга с помощью рестриктазы, которая расщепляет их общую 5'-фланкирующую область (Garabedian et al., 1985). Затем каждый из этих генов может быть клонирован отдельно в векторе мобильного Р-элемента, который способен встраиваться в геном яиц дрозофилы. Прежде чем трансформировать ДНК дрозофилы этими клонами, в гены ур были введены дополнительные фрагменты плазмидной ДНК, для того чтобы продукты этих генов можно было отличить от продуктов эндогенных генов. Транскрипты с рекомбинантных клонов, подобно эндогенным мРНК, оказались специфичными в отношении пола (они присутствовали только у самок) и стадии развития (обнаруживались только у взрослых особей). Однако ур2-мРНК была обнаружена только в яичнике, а ур1-мРНК только в жировых телах. Исходные гены желточного белка должны, очевидно, иметь на своих 5'-концах два энхансера, один разрешающий транскрипцию в яичнике и другой разрешающий транскрипцию в жировых телах. Таким образом, оба гена транскрибируются в норме в клетках обоих типов. Рестриктаза, однако, разрезает ДНК между этими двумя сайтами, оставляя для yp1 энхансер, специфичный для жирового тела, а для ур2 энхансер, специфичный для яичника.

Было обнаружено, что энхансер гена ур1, специфичный для жирового тела, располагается в сегменте ДНК между 196-й и 321-й парами оснований выше (с 5'-стороны от) кэп-сайта. Это определили с помощью добавления различных фрагментов 5'-


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

148_______________ ГЛАВА 12__________________________________________________________

 

*— Рис. 12.l1. Протокол идентификации двух отдельных энхансерных элементов, контролирующих тканевую специфичность транскрипции желточных белков. Гены желточных белков и их 5'-фланкирующие элементы отделяли друг от друга с помощью рестриктаз (Hind III) обозначена как Н). Затем эти гены модифицировали присоединением добавочной ДНК к экзону и клонировали в мобильном Р-элементе. В синцитиальную бластодерму с помощью микроинъекции вводили рекомбинантный Р-элемент, который включался в некоторые ядра. Иногда Р-элемент попадал в клетки зародышевой линии. Такие мухи затем спаривались с интактными особями. Потомство, которое получило гены Р-элемента, можно было идентифицировать по окраске глаз (благодаря генетическому маркеру в Р-элементе), а отдельные органы могли быть тестированы на присутствие транскриптов ур1 и ур2.

 

фланкирующей последовательности к гену ß-галактозидазы E. coli. Полученные гены клонировали в Р-элементе. который затем вводили зародышам, как это было описано ранее. Потомство тех зародышей, которые включили Р-элемент, окрашивали на ß-галактозидазу (Garabedian et al., 1986). Результаты можно видеть на цветной фотографии, помещенной на одной из сторон обложки книги. В жировом теле и яичнике в отсутствие 5’-фланкирующей области ß-галактозидаза не выявляется.


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

________________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ_____________________________ 149

 

Рис. 12.12. Локализация энхансерных элементов желточных белков. А. Экспрессия гена бактериальной ß-галактозидазы с присоединенным участком от —44 до –350 с 5'-стороны гена ур2 в яичниках Drosophila. Клетки, экспрессирующие ß-галактозидазу, окрашены в темный цвет. Б. Схема энхансеров желточных белков у дрозофилы. (Полученные сравнительно недавно данные предполагают также наличие третьего элемента, расположенного между положениями —100 и +1 гена ур2 и увеличивающего транскрипцию обоих генов.) (Фотография с любезного разрешения P. Wensink.)

 

Если добавляли целую 5'-фланкирующую область гена ур1, то жировые тела, но не яичник, окрашивались в черный цвет (только у самок). Эта специфическая транскрипция сохранялась, когда использовали фрагмент от –321-го до –196-го положения. Следовательно, специфичная для жирового тела транскрипция регулируется участком ДНК, длиной 125 пар оснований, который расположен между –196-м и –321-м положениями. Сходным образом последовательность энхансера, отвечающего за спе-

 

Рис. 12.13. Протокол определения сайта энхансера глюкокортикоидов. Подробности см. в тексте.

 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

150_______________ ГЛАВА 12_____________________________________________________________________________

цифическую для яичника транскрипцию, была локализована в области 44-350 пар оснований выше гена ур2 (рис. 12.12).



©2015- 2019 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.