Сделай Сам Свою Работу на 5

Активация репрессированного хроматина

Доступность для транс-регупяторных факторов

Эксперименты по гибридизации в растворах свидетельствуют, что в геноме большинства позвоночных имеется по меньшей мере 10 000 тканеспецифических генов: и в клетках любого конкретного типа активность почти всех этих генов репрессирована. Обычно считают, что «молчащее» состояние хроматина является репрессированным и что тканеспецифические гены активируются локальным удалением ингибирующих факторов (Weintraub, 1985). Как отмечено выше, главным механизмом общей репрессии генов является, вероятно, компактизация ДНК в кластеры нуклеосом. Если ДНК оказывается закрученной в эти плотные структуры, транс-регуляторные факторы инициации транскрипции не в состоянии найти последовательности ДНК. с которыми они могли бы связаться (Schlissel, Brown, 1984). Когда ДНК, содержащая промотор, входит в состав нуклеосом, соответствующие гены не могут транскрибироваться (Workman, Roeder, 1987). Однако, если к этим генам перед сборкой нуклеосом или во время сборки добавлен белок, связывающийся с ТАТА-боксом (TFIID), то реконструированный хроматин оказывается транскрипционно активным.

Специфическая для клеточного типа активация генов может проходить поэтому в два этапа. Во-первых, участок хроматина должен развернуться так, чтобы ген и его промотор стали доступными для транскрипционных факторов и РНК-полимеразы. Во-вторых, чтобы связаться с экспонированной ДНК, эти транскрипционные факторы должны присутствовать в ядрах.

Имеются данные, что в любой конкретной клетке транскрибируемые гены более доступны для РНК-полимеразы и транс-регуляторных факторов, чем нетранскрибируемые. (Иными словами, репрессирующая система отменена локально в этих участках.) Основные данные в пользу этого положения получены в работах по определению чувствительности специфических генов различных клеток к ДНКазе. Доступность гена к ядерным белкам может быть оценена при обработке хроматина ткани небольшими количествами ДНКазы I (ДНКаза, отличающаяся по специфичности от микрококковой ДНКазы). Из обработанного хроматина экстрагируют ДНК и смешивают с радиоактивной кДНК для конкретного гена (рис. 12.25). Если кДНК находит последовательности для связывания, значит, соответствующий ген был защищен белками хроматина от переваривания ДНКазой (он был для нее недоступен), и этот ген будет, вероятно, недоступен также для РНК-полимеразы. Однако если зонд кДНК не находит последовательности для связывания, значит, этот ген был экспонирован для ДНКазы и будет, вероятно, доступен для РНК-полимеразы и транс-регуляторных факторов.



Было обнаружено, что чувствительность определенного гена к ДНКазе I зависит от типа клеток, в которых он находится (табл. 12.2) (Weintraub, Groudine, 1976). Когда хроматин из развивающихся эритроцитов курицы был обработан ДНКазой I,


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

_________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ__________________________________ 163

 

Рис. 12.25. Протокол опыта по определению специфичности гидролиза хроматина ДНКазой I. Результаты опыта см. в табл. 12.2.

затем из него была экстрагирована ДНК и смешана с радиоактивной глобиновой кДНК, глобиновой кДНК практически не было с чем связываться. Глобиновые гены в хроматине оказались гидролизованными небольшими количествами ДНКазы I. Однако обработка теми же количествами ДНКазы I хроматина из клеток мозга не приводила к деградации глобиновых генов. Поэтому глобиновые гены доступны для экзогенных ферментов в хроматине развивающихся эритроцитов, но не в хроматине клеток мозга.

Сходным образом ген овальбумина доступен для переваривания ДНКазой I в хроматине яйцевода и недоступен в хроматине эритроцитов. Когда хроматин обрабатывают ДНКазой I и экстрагируют ДНК, овальбуминовая кДНК способна найти комплементарные последовательности в препаратах из эритроцитов, но не в ДНК из хроматина яйцевода. Таким образом, здесь мы имеем четкую корреляцию между дифференциальной регуляцией генов и структурой хроматина.

Сайты, гиперчувствительные к ДНКазе

Помимо сайтов, чувствительных к ДНКазе I, существуют сайты, гиперчувствительные к ДНКазе I. Эти сайты, идентифицированные с помощью небольших радиоактивных фрагментов ДНК, гидролизуются крайне низкими количествами ДНКазы I, что свидетельствует об их чрезвычайной доступности для внешних молекул. Почти все гиперчувствительные участки, связанные с генами, активность которых регулируется в развитии, тканеспецифичны (Ligin, 1981; Conklin, Groudine, 1984). Сайты, гиперчувствительные к ДНКазе I, содержатся в глобиновых генах эритроцитов и их непосредственных пред-

Таблица 12.2 Опыты по связыванию кДНК-зондов с хроматином, обработанным ДНКазой I

Источник хроматина. обработанного ДНКазой I Радиоактивный кДНК-зонд Максимальное связывание радиоактивной кДНК с ДНК, экстрагированной из обработанного хроматина. %
ДНК эритроцитов курицы (без обработки ДНКазой) Глобиновая кДНК
Хроматин клеток мозга курицы Глобиновая кДНК 90–100
Хроматин фибробластов курицы Глобиновая кДНК 90–100
Хроматин эритроцитов курицы Глобиновая кДНК
Хроматин эритроцитов курицы Овальбуминовая кДНК 90–100
Источник: Weintraub, Groudine, 1976.

 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

164_______________ ГЛАВА 12_____________________________________________________________________________

шественников, но не содержатся в глобиновых генах других клеток (Stalder et al., 1980). В предшественниках эритроцитов из печени плода сайты, гиперчувствительные к ДНКазе 1, лежат в пределах 200 пар оснований с5'-стороны от кэп-сайтов в генах β-, γи δ-цепей глобина. Если хроматин экстрагируют из клеток костного мозга взрослых особей, то только δ- и β(взрослые)-глобиновые гены обнаруживают гиперчувствительность к ДНКазе I (Groudine et al., 1983). 5’-Фланкирующая область гена вителлогенина курицы содержит несколько гиперчувствительных сайтов в хроматине из печени кур-несушек, но эти сайты отсутствуют в хроматине печени петухов, хроматине эмбриональной печени, хроматине лимфоцитов и клеток мозга (Burch, Weintraub, 1983). Когда сайт, гиперчувствительный к ДНКазе I, был делетирован из 5'-области регулируемого в развитии гена белка из клеток слюнных желез дрозофилы, транскрипты этого гена не обнаруживались, а молекулы РНК-полимеразы не связывались с промотором этого гена (Shermoen, Beckendorf, 1982; Steiner et al., 1984).

Такие гиперчувствительные сайты располагаются обычно внутри или поблизости от сайтов, которые выполняют функции энхансеров. При исследовании энхансера, отвечающего на глюкокортикоид в вирусе рака молочной железы мыши, было обнаружено, что перед добавлением гормона к клеткам, несущим вирус, эта энхансерная последовательность не обладает повышенной чувствительностью к ДНКазе I (Zaret, Yamamoto, 1984). После введения гормона в этом участке появляется дискретный сайт, гиперчувствительный к ДНКазе I. Образование гиперчувствительного сайта совпадает с инициацией транскрипции вирусных генов; когда гормон удаляют, гиперчувствительный сайт исчезает и транскрипция вирусных генов прекращается. Исследователи полагают, что взаимодействие между комплексом глюкокортикоид–рецептор и ДНК энхансера изменяет конфигурацию хроматина, способствуя транскрипции с ближайшего промотора.

Внутри гиперчувствительного участка овальбуминового гена курицы картирован сайт связывания прогестерона (Mulvihill et al., 1982). Введение эстрогена способно индуцировать образование четырех сайтов, чувствительных к ДНКазе I, в 5'-фланкирующей области этого гена (Кaye et al., 1986), однако после удаления эстрогена три из этих сайтов исчезают. Энхансеры для гена инсулина крысы и β-глобинового гена курицы также лежат внутри участков, гиперчувствительных к ДНКазе I (Emerson et al., 1985; Ohlsson, Edlund, 1986).



©2015- 2019 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.