Активация репрессированного хроматина

Доступность для транс-регупяторных факторов

Эксперименты по гибридизации в растворах свидетельствуют, что в геноме большинства позвоночных имеется по меньшей мере 10 000 тканеспецифических генов: и в клетках любого конкретного типа активность почти всех этих генов репрессирована. Обычно считают, что «молчащее» состояние хроматина является репрессированным и что тканеспецифические гены активируются локальным удалением ингибирующих факторов (Weintraub, 1985). Как отмечено выше, главным механизмом общей репрессии генов является, вероятно, компактизация ДНК в кластеры нуклеосом. Если ДНК оказывается закрученной в эти плотные структуры, транс-регуляторные факторы инициации транскрипции не в состоянии найти последовательности ДНК. с которыми они могли бы связаться (Schlissel, Brown, 1984). Когда ДНК, содержащая промотор, входит в состав нуклеосом, соответствующие гены не могут транскрибироваться (Workman, Roeder, 1987). Однако, если к этим генам перед сборкой нуклеосом или во время сборки добавлен белок, связывающийся с ТАТА-боксом (TFIID), то реконструированный хроматин оказывается транскрипционно активным.

Специфическая для клеточного типа активация генов может проходить поэтому в два этапа. Во-первых, участок хроматина должен развернуться так, чтобы ген и его промотор стали доступными для транскрипционных факторов и РНК-полимеразы. Во-вторых, чтобы связаться с экспонированной ДНК, эти транскрипционные факторы должны присутствовать в ядрах.

Имеются данные, что в любой конкретной клетке транскрибируемые гены более доступны для РНК-полимеразы и транс-регуляторных факторов, чем нетранскрибируемые. (Иными словами, репрессирующая система отменена локально в этих участках.) Основные данные в пользу этого положения получены в работах по определению чувствительности специфических генов различных клеток к ДНКазе. Доступность гена к ядерным белкам может быть оценена при обработке хроматина ткани небольшими количествами ДНКазы I (ДНКаза, отличающаяся по специфичности от микрококковой ДНКазы). Из обработанного хроматина экстрагируют ДНК и смешивают с радиоактивной кДНК для конкретного гена (рис. 12.25). Если кДНК находит последовательности для связывания, значит, соответствующий ген был защищен белками хроматина от переваривания ДНКазой (он был для нее недоступен), и этот ген будет, вероятно, недоступен также для РНК-полимеразы. Однако если зонд кДНК не находит последовательности для связывания, значит, этот ген был экспонирован для ДНКазы и будет, вероятно, доступен для РНК-полимеразы и транс-регуляторных факторов.

Было обнаружено, что чувствительность определенного гена к ДНКазе I зависит от типа клеток, в которых он находится (табл. 12.2) (Weintraub, Groudine, 1976). Когда хроматин из развивающихся эритроцитов курицы был обработан ДНКазой I,

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

_________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ__________________________________ 163

Рис. 12.25. Протокол опыта по определению специфичности гидролиза хроматина ДНКазой I. Результаты опыта см. в табл. 12.2.

затем из него была экстрагирована ДНК и смешана с радиоактивной глобиновой кДНК, глобиновой кДНК практически не было с чем связываться. Глобиновые гены в хроматине оказались гидролизованными небольшими количествами ДНКазы I. Однако обработка теми же количествами ДНКазы I хроматина из клеток мозга не приводила к деградации глобиновых генов. Поэтому глобиновые гены доступны для экзогенных ферментов в хроматине развивающихся эритроцитов, но не в хроматине клеток мозга.

Сходным образом ген овальбумина доступен для переваривания ДНКазой I в хроматине яйцевода и недоступен в хроматине эритроцитов. Когда хроматин обрабатывают ДНКазой I и экстрагируют ДНК, овальбуминовая кДНК способна найти комплементарные последовательности в препаратах из эритроцитов, но не в ДНК из хроматина яйцевода. Таким образом, здесь мы имеем четкую корреляцию между дифференциальной регуляцией генов и структурой хроматина.

Сайты, гиперчувствительные к ДНКазе

Помимо сайтов, чувствительных к ДНКазе I, существуют сайты, гиперчувствительные к ДНКазе I. Эти сайты, идентифицированные с помощью небольших радиоактивных фрагментов ДНК, гидролизуются крайне низкими количествами ДНКазы I, что свидетельствует об их чрезвычайной доступности для внешних молекул. Почти все гиперчувствительные участки, связанные с генами, активность которых регулируется в развитии, тканеспецифичны (Ligin, 1981; Conklin, Groudine, 1984). Сайты, гиперчувствительные к ДНКазе I, содержатся в глобиновых генах эритроцитов и их непосредственных пред-

Таблица 12.2 Опыты по связыванию кДНК-зондов с хроматином, обработанным ДНКазой I

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

164_______________ ГЛАВА 12_____________________________________________________________________________

шественников, но не содержатся в глобиновых генах других клеток (Stalder et al., 1980). В предшественниках эритроцитов из печени плода сайты, гиперчувствительные к ДНКазе 1, лежат в пределах 200 пар оснований с5'-стороны от кэп-сайтов в генах β-, γи δ-цепей глобина. Если хроматин экстрагируют из клеток костного мозга взрослых особей, то только δ- и β(взрослые)-глобиновые гены обнаруживают гиперчувствительность к ДНКазе I (Groudine et al., 1983). 5’-Фланкирующая область гена вителлогенина курицы содержит несколько гиперчувствительных сайтов в хроматине из печени кур-несушек, но эти сайты отсутствуют в хроматине печени петухов, хроматине эмбриональной печени, хроматине лимфоцитов и клеток мозга (Burch, Weintraub, 1983). Когда сайт, гиперчувствительный к ДНКазе I, был делетирован из 5'-области регулируемого в развитии гена белка из клеток слюнных желез дрозофилы, транскрипты этого гена не обнаруживались, а молекулы РНК-полимеразы не связывались с промотором этого гена (Shermoen, Beckendorf, 1982; Steiner et al., 1984).

Такие гиперчувствительные сайты располагаются обычно внутри или поблизости от сайтов, которые выполняют функции энхансеров. При исследовании энхансера, отвечающего на глюкокортикоид в вирусе рака молочной железы мыши, было обнаружено, что перед добавлением гормона к клеткам, несущим вирус, эта энхансерная последовательность не обладает повышенной чувствительностью к ДНКазе I (Zaret, Yamamoto, 1984). После введения гормона в этом участке появляется дискретный сайт, гиперчувствительный к ДНКазе I. Образование гиперчувствительного сайта совпадает с инициацией транскрипции вирусных генов; когда гормон удаляют, гиперчувствительный сайт исчезает и транскрипция вирусных генов прекращается. Исследователи полагают, что взаимодействие между комплексом глюкокортикоид–рецептор и ДНК энхансера изменяет конфигурацию хроматина, способствуя транскрипции с ближайшего промотора.

Внутри гиперчувствительного участка овальбуминового гена курицы картирован сайт связывания прогестерона (Mulvihill et al., 1982). Введение эстрогена способно индуцировать образование четырех сайтов, чувствительных к ДНКазе I, в 5'-фланкирующей области этого гена (Кaye et al., 1986), однако после удаления эстрогена три из этих сайтов исчезают. Энхансеры для гена инсулина крысы и β-глобинового гена курицы также лежат внутри участков, гиперчувствительных к ДНКазе I (Emerson et al., 1985; Ohlsson, Edlund, 1986).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: