Дополнительные сведения и гипотезы: Модульные гены

В 1978 г. Уолтер Гилберт предложил радикальную гипотезу для объяснения существования интронов. Он предположил, что эукариотический геном состоит из модульных единиц, что позволяет «смешивать и сочетать» части. Экзоны кодируют функциональные домены белков и могут сортироваться в ходе эволюции независимо. В 1979 г. начали появляться первые данные в пользу этой гипотезы. Структура тяжелой γ-цепи иммуноглобулина состоит из пяти доменов, каждый из которых имеет специфическую функцию. Домен СНЗ участвует во взаимодействиях поверхностей клеток, домен СН2 присоединяет молекулы комплемента, шарнирный домен позволяет изгибаться антигенсвязывающим сайтам, домен СН1 присоединяется к легкой цепи, а домен вариабельной области формирует антигенсвязывающий сайт. Каждый из этих доменов кодируется отдельным экзоном (рис. 12.17) (Sakano et al., 1979). Функциональные домены ряда белков, в том числе глобинов, кристаллинов хрусталика и белков клеточного узнавания большого комплекса тканевой совместимости, также отражают расположение своих экзонов (Inana et al., 1983; Gilbert, 1985).

Рис 12.17. Соотношение между экзонами гена и доменами глобулярного белка для тяжелой цепи IgG. Каждый домен белка кодируется отдельным экзоном. (Данные из Sakano et al., 1979.)

Рецептор липопротеина низкой плотности (ЛНП) предоставил первое свидетельство перемешивания экзонов которое предполагает, что экзоны могут дуплицироваться в одном гене и затем рекрутироваться для использования в другом гене. Ген этого белка был секвенирован (что оказалось непростым делом, так как он содержит 18 экзонов), и было проведено сравнение его последовательности с другими генами и с функциональными доменами ЛНП-рецептора (Südhof et al., 1985). Оказалось, что участок из 400 аминокислот в ЛНП-рецепторе кодируется восемью соседними экзонами, которые очень похожи на восемь экзонов гена фактора роста эпидермиса. В этом же гене был обнаружен еще один домен ЛНП-рецептора размером в 40 аминокислот. Помимо этого ген ЛНП-рецептора содержит серию экзонов, общих с геном белка С9 комплемента (рис. 12.18). Таким образом, ген ЛНП-рецептора оказывается мозаикой из экзонов, полученных из нескольких различных источников.

Если экзоны могут быть перемещены в новые гены, не могут ли быть перемещены также и энхансеры? Вопрос этот крайне важен, поскольку многие зволюционные события можно было бы объяснить изменением времени или места экспрессии генов. Эта гипотеза проверялась на гавайских видах дрозофилы (Rabinow, Dickinson, 1986). Видообразование у этих мух идет с исключительно высокой скоростью, и несколько видов обнаруживают различия в тканевой специфичности экспрессии генов. Например, у личинки D. hawaiiensis ген алкогольдегидрогеназы (АДГ) экспрессируется в жировых телах и каркасе, тогда как у личинки D.formella ген алкогольдегидрогеназы экспрессируется только в жировых телах. Оба фермента можно различить с помощью электрофореза. Эти виды можно спарить друг с другом и получить гибридные личинки. Когда были исследованы жировые тела этих личинок, в них были обнаружены оба фермента АДГ специфичный для D. hawaiiensis и специфичный для D.formella. Однако при анализе каркаса был обнаружен белок только из D.hawaiiensis. Такое распределение можно ожидать, если гены АДГ контролируются цис-регуляторными элементами, которые различаются у этих двух близкородственных видов. (Если бы экс-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ 155

Рис 12.18. Модульная структура доменов рецептора ЛНП. Шесть доменов белка показаны в виде прямоугольников, кодирующие их экзоны обозначены цифрами между стрелкаминад картой белка. Области, гомологичные другим группам экзонов, указаны под картой. (Из Südhof et al., 1985 )

прессия определялась транс-регуляторными элементами, то оба гена были бы либо включены, либо выключены.) Это наблюдение свидетельствует о том, что энхансеры могут меняться в ходе эволюции, благодаря чему в различных тканях будут синтезироваться различные продукты.

Метилирование ДНК

Нередко полагают, что ген состоит из одних и тех же нуклеотидов, когда он активен и когда он неактивен. Ген ß-цепи глобина в предшественнике эритроцитов должен иметь те же нуклеотиды, что и ген ß-цепи глобина в фибробласте того же организма. В 1948 г. в ДНК было открыто «пятое основание» 5-метилцитозин (Hotchkiss,1948). Это основание образуется ферментативным путем после репликации ДНК, и около 5% цитозинов в ДНК млекопитающих переводится в 5-метилцитозин. Эта конверсия может происходить только в том случае, когда за цитидиновым остатком следует гуанозин (ЦфГ). Недавние исследования показали, что степень метилирования цитозинов в гене может контролировать его транскрипцию. Другими словами, метилирование ДНК может менять структуру гена и благодаря этому регулировать его активность.

Первые данные о том, что метилирование ДНКпомогает регулировать активность генов, были получены в исследованиях, показавших корреляцию между активностью гена и его неметилированием (гипометилированием), особенно в области промотора гена. В развивающихся эритроцитах человека и курицы ДНК, участвующаяв синтезе глобинов, полностью или почти полностью неметилирована, тогда как те же гены в клетках, которые не синтезируют глобины, метилированы в высокой степени (рис. 12.19. А). Клетки печени плода, которые синтезируют гемоглобин на ранних стадиях развития. имеют неметилированные гены для фетального гемоглобина. Эти гены становятся метилированными в тканях взрослого организма (van der Ploeg, Flavell, 1980; Groudine, Weintraub, 1981).

Специфическое для органа метилирование наблюдается также в гене овальбумина курицы, этот ген не метилирован в клетках яйцевода, но метилирован в других тканях курицы (Mandel, Chamhon, 1979). Деметилирование сопровождает переключение классов при синтезе иммуноглобулинов (Rogers, Wall, 1981) и коррелирует со способностью грызунов продуцировать металлсвязывающий белок металлотионеин 1 (Compere, Palmiter, 1981). Таким образом, отсутствие метилирования ДНК хорошо коррелирует с тканеспецифической экспрессией определенных генов.

Вторая группа данных, свидетельствующих о том, что метилирование ДНК является регуляторным процессом, получена в опытах, где экспрессию клонированных генов изменяли с помощью введения или удаления метильных групп из остатков цитозина. Один из таких опытов еще раз подтвердил, что гипометилирование необходимо для транскрипции β-глобинового гена человека (Busslinger et al., 1983). Когда глобиновые гены клонировали и добавили к клеткам с помощью переосаждения с фосфатом кальция, клетки захватывали ДНК и нередко включали эту ДНК в ядра. В таких случаях клонированный глобиновый ген транскрибировался. С помощью защиты от метилирования определенных участков клонированных генов перед их добавлением к клеткам можно получить клоны, в которых глобиновые гены имеют идентичные последовательности, но разный характер метилирования (рис. 12.19.Б). Полностью неметилированный ген транскрибировался, тогда как полностью метилированный ген (метильная группа на каждом подходящем остатке Ц) не транскрибировался. С использованием частично метилированных клонов было показано, что метилирование в 5’-области глобинового гена (нуклеотиды от –760 до +100) предотвращает транскрипцию. Таким образом, метилирова-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

156_______________ ГЛАВА 12_______________________________________________________________________

Рис. 12.19. Схема метилирования глобиновых генов. А. Метилирование ß-цепей глобина кролика (ß1, ß2, ß3, ß4). Каждый ген этого кластера представлен серым квадратом. Последовательности ЦЦГГ обозначены кружками, причем черными кружками обозначены те из них, которые полностью метилированы только в клетках, не транскрибирующих глобины. Б. Метилирование контролирует транскрипцию клонированного гена фетального γ-глобина человека. На верхней диаграмме показаны клонированный глобиновый ген и его 5'- и 3'-фланкирующие области. Экзоны обозначены черным цветом, интроны – белым, фланкирующие области – тонкими линиями. Под диаграммой представлена карта возможных сайтов метилирования ДНК, которые представляют собой участки, где присутствует динуклеотид ЦфГ. Под этой картой приведены схемы метилирования пяти клонов, которые были изучены в данной работе. Прямыми линиями изображены неметилированные сегменты, волнистыми – метилированные. Знаки + и – с правой стороны рисунка указывают на то, экспрессировались или не экспрессировались данные сегменты. (А – по Shen, Maniatis, 1980; Б – по Busslinger et al., 1983.)

ние на 5’-конце гена играет, по-видимому, главную роль в регуляции экспрессии генов.

Третья группа данных получена в экспериментах, в которых изначально неактивные гены активировались при их деметилировании непосредственно внутри ядер. Была получена корреляция между активацией молчащих генов и утратой метильных групп из их цитозинов. Из гл. 10 мы узнали, что неактивные гены, специфичные для печени, могут быть активированы в фибробластах мыши после слияния этих фибробластов с клетками печени. Эта активация сопровождается деметилированием генов, специфических для печени особенно в их 5'-областях (Sellem et al., 1985). Когда 5'-области этих генов деметилированы, они похожи на активные гены, специфические для печени, и активно транскрибируют РНК.

Другой метод деметилирования генов заключается в обработке клеток препаратом 5-азацитидином. Полагают, что это соединение ингибирует метилтрансферазу, что приводит к деметилированию той ДНК, которая обычно является метилированной (Razin et al., 1984). Когда 5-азацитидин добавляли к колониям мышиных фибробластов С3Н10Τ1/2, эти клетки с высокой частотой превращались в миоциты, адипоциты или хондроциты (Taylor, Jones, 1982; Konieczny, Emerson, 1984). Полученные фенотипы были стабильны, на основании чего можно предположить, что характер метилирования передается через многие циклы клеточных делений. Было показано, что ДНК из миобластов, полученных из обработанных 5-азацитидином клеток C3H10T1/2, способна превращать другие клетки C3H10T1/2в миобласты, тогда как ДНК из необработанных клеток С3Н10Т1/2 не обладает этой способностью (Lassar et al., 1986).

Четвертая группа данных, свидетельствующих о регуляции транскрипции с помощью метилирования ДНК, получена в исследованиях инактивации Х-хромосомы у млекопитающих. В этом случае метилирование ДНК играет главную роль в поддержании неактивного состояния одной из двух Х-хромосом в каждой клетке. Предположение о существовании определенных различий в ДНК хромосом впервые возникло на основе данных, полученных в опытах по трансфекции гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (ГФРТ), связанного с Х-хромосомой, в мышиные клетки фенотипа ГФРТ^– (Liskay, Evans, 1980). Когда использовали клон клеток, в которых ген находился на неактивной Х-хромосоме, получен-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ_________________________ 157

ная ДНК была неспособна вызвать синтез фермента в клетке-хозяине ГФРТ^–. Когда ДНК получали из клона клеток, имеющих ген ГФРТ на активной Х-хромосоме, в трансформированных клетках фермент синтезировался.

Годом позже было получено еще одно подтверждение того, что метилирование играет в инактивации Х-хромосомы определенную роль: тогда было обнаружено, что 5-азацитидин локально реактивирует гены на неактивной Х-хромосоме. Группа исследователей сконструировала гибридные клетки, в которых были активная Х-хромосома мыши и неактивная Х-хромосома человека (Mohandas et al., 1981). После обработки 5-азацитидином были обнаружены клоны клеток, которые синтезировали фермент ГФРТ с Х-хромосомы человека.

И наконец, оказалось, что некоторые конститутивные ферменты, кодируемые Х-хромосомой (т. е. те ферменты, которые должны присутствовать в каждой клетке, а не только в специализированных), имеют на 5’-концах своих генов кластеры из ЦГ-богатых участков. В активной Х-хромосоме по крайней мере у трех генов 5'-кластеры гипометилированы, тогда как эти же кластеры в аналогичных генах на неактивной Х-хромосоме интенсивно метилированы (Wolf et al., 1982; 1984; Keith et al., 1986). Сходным образом группы ЦфГ на 3'-концах генов более метилированы в неактивной Х-хромосоме. чем в активной. Когда Х-хромосома реактивируется (естественным образом, как в ворсинках хориона или в опыте с 5-азацитидином). эти кластеры становятся гипометилированными ¹ (Wolf et al., 1984). Помимо этого, когда клетки тератокарциномы дифференцируются и одна из Х-хромосом инактивируется. ЦфГ-кластеры на этих генах становятся метилированными (Lock et al., 1987). Хотя инициатор инактивации Х-хромосомы до сих пор неизвестен, весьма вероятно, что метилирование ДНК поддерживает неактивное состояние Х-хромо-

¹ Большая часть изученных к настоящему времени генов, зависимых от РНК-полимеразы II, являются генами, продукты которых (например, гемоглобин, овальбумин и коллаген) характеризуют клетку определенного типа. Это вызвано тем, что такие гены производят необычно большое количество конкретных мРНК, которые могутбыть легко изолированы и затем использованы как зонды для клонированных генов. Эти гены регулируются в развитии так, что их экспрессия происходит в специфических типах клеток в определенные периоды времени. Те гены, которые не регулируются в развитии (их продукты присутствуют в большинстве клеток на всех стадиях), могут контролироваться другим образом и иметь другую структуру. Для таких генов не нужны последовательности ТАТА или ЦААТ (Mellon et al., 1986; Reynolds et al., 1984). Они, по-видимому, должны иметь кластеры ЦфГ вблизи 5’-концов. Эти кластеры обычно гипометилированы и находятся в участках, гиперчувствительных к ДНКазе I (Wolf, Migeon, 1984)

Рис. 12.20. Мидель передачи характера метилирования дочерним молекулам. В ходе репликации исходный тип метилирования сохраняется лишь в одной из двух цепей ДНК (в «старой»). Другая цепь («новая») не метилирована. Фермент метилирования, специфичный к ЦГ. может присоединяться к тем ЦГ-парам. где остаток Ц метилирован, и затем метилировать остаток Ц на комплементарной цепи. (По Browder. 1984.)

сомы и передает его от одного поколения клеток к другому (Kaslow, Migeon, 1987).

Если предложенная гипотеза о деметилировании справедлива, то распределение метилированных и деметилированных цитозинов должно устойчиво наследоваться на протяжении многих клеточных делений и «стираться» в половых клетках. Так в действительности и происходит. Установленный в клетках специфический характер метилирования стабилен на протяжении более 100 клеточных делений (Wigler et al., 1981; Stein et al., 1982). Предложен механизм для передачи этого распределения (Stein et al., 1982). Когда исследователи трансфицировали клетку гемиметилированной ДНК (т.е. ДНК. в которой только одна цепь метилирована), то метилирование ЦГ было обнаружено у всего клонального потомства этой клетки после многих клеточных делений. Предположили, что ЦГ-специфический метилирующий фермент использует метилированные цитидины как матрицу для метилирования цитидинов на компле-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

158_______________ ГЛАВА 12__________________________________________________________

ментарной цепи (рис. 12.20). Это объясняет также, почему за метилированными цитидинами всегда следуют гуанозины.

В развивающихся спермиях не наблюдается ни одно из распределений гипометилирования, характерных для соматических клеток. Все специфические для клеток гены (глобинов, овальбумина, иммуноглобулинов и т.д.) являются высокометилированными. Большая часть гипометилированных сайтов, обнаруженных до сих пор в сперматозоидах (предшественниках спермиев), оказываются метилированными в зрелых спермиях. По разнице в метилировании генов спермия и яйца можно определить, получен ли ген от отца или от матери. Если ядра первичных половых клеток и у самцов, и у самок резко гипометилированы (Monk et al., 1987), то гены спермия и яйца интенсивно метилированы. Кроме того, характер метилирования данного гена в яйце и спермии может различаться (Reik et al., 1987; Sapienza et al., 1987). Этот материнский и отцовский импринтинг добавляет информацию к наследуемым геномам – информацию, которая может регулировать активность генов и поведение хромосом в пространстве и во времени. В эксперименте была получена линия трансгенных мышей, у которых в геном был встроен ген, индуцирующий образование опухоли (этот процесс будет рассмотрен в гл. 20) (Swain et al., 1987). Если этот ген был унаследован от самца, то он транскрибировался исключительно в сердце, но ни в какой другой ткани. В случае если этот ген наследовался от самки, он не экспрессировался вовсе. Этот характер экспрессии коррелировал со степенью метилирования. Рассматриваемый ген метилировался в ходе созревания яйца и деметилировался при образовании спермия. Такая специфичная для гамет разница в метилировании дает правдоподобное объяснение неспособности к развитию партеногенетических млекопитающих и необходимости присутствия в зиготе обоих пронуклеусов отцовского и материнского.

Очевидно, что метилирование является важным механизмом регуляции активности генов, но оно не может применяться для всех генов. По-видимому, этот процесс широко распространен среди позвоночных, но даже у них некоторые гены сохраняют способность к транскрипции, хотя и являются метилированными (Gerber-Huber et al., 1983). Кроме того, метилирования ДНК не происходит, очевидно, у дрозофилы, где тканеспецифическая транскрипция генов хорошо документирована.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: