Альтернативный процессинг РНК и детерминация пола

Даже если дифференциальный процессинг РНК действительно генерирует некоторые из белков, характеризующих тип дифференцированных клеток, это не обязательно означает, что альтернативный сплайсинг РНК участвует в более ранних событиях, которые определяют судьбу клеток. Однако недавние исследования убедительно свидетельствуют о том, что дифференциальный процессинг РНК играет основную роль в детерминации полового фенотипа дрозофилы (Baker et al., 1987; Boggs et al., 1987).

Как мы увидим в гл. 21. в развитии полового фенотипа у дрозофилы участвуют группы генов, которые преобразуют отношение Х-хромосома:аутосома в мужской или женский тип. Одним из ключевых генов в этом процессе является ген transformer. Этот ген необходим для дифференцировки самок, и его утрата приводит к появлению самцов независимо от соотношения хромосом. На протяжении всего личиночного периода ген transformer активно синтезирует транскрипт, который проходит процессинг в неспецифическую мРНК (имеющуюся и у

Рис. 13.14 Транскрипты с половой специфичностью в развитии дрозофилы. А. Специфичные для самок и общие транскрипционные продукты, генерируемые геном transformer с помощью альтернативного сплайсинга РНК. Стрелкой указан стоп-кодон УГА, который присутствует в экзонах общего транскрипта, но не включается в состав мРНК, специфичной для самок, так как расположен в интроне этого гена. Экзоны представлены в виде прямоугольников, интроны изображены тонкими линиями. Б. Альтернативный сплайсинг РНК гена doublesex. На стадии образования куколки ген doublesex будет синтезировать продукты, специфичные для самцов, или продукты, специфичные для самок, в зависимости от того, активны ли гены tra и tra-2. (A – по Boggs et al., 1987; Б – по Baker et al., 1987.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

190_______________ ГЛАВА 13_____________________________________________________________________________

самок, и у самцов) или специфическую для самок мРНК (рис. 13.14, А). Только самки содержат мРНК, образованную при альтернативном сплайсинге, и она является единственной функциональной мРНК, синтезируемой этим геном. Неспецифическая мРНК, присутствующая и у самцов, и у самок, содержит стоп-кодон (УГА) в начале второго экзона. В отличие от этого в специфической для самок мРНК кодон УГА находится в интроне и не влияет на трансляцию мРНК. Белок, кодируемый такой мРНК, содержит большое количество аргинина, а его длина составляет около 196 аминокислот (Boggs et al., 1987).

В процессе детерминации пола дрозофилы ген transformer контролирует, по-видимому, экспрессию основного гена doublesex (dsx). Ген doublesex необходим для формирования фенотипа любого пола, и мутации в этом гене подавляют образование семенников и яичников. На стадии формирования куколки ген doublesex синтезирует транскрипт, который может подвергнуться процессингу двумя альтернативными способами. Он может генерировать мРНК, специфичную для самок, или мРНК, специфичную для самцов (рис. 13.14. Б) (Baker et al., 1987). У самок и самцов первые три экзона этого гена одинаковы, а четвертые экзоны различаются. В специфичной для самцов РНК делетирован большой фрагмент РНК-предшественника, который включает в себя специфичный для самок экзон.

Авторы этой работы полагают, что гены детерминации пола, функционирующие ранее гена doublesex (transformer и transformer-2 ), нужны для образования фактора сплайсинга, который обеспечивает процессинг РНК-предшественника в мРНК, специфичную для самок. Если оба гена transformer отсутствуют (как при мутациях) или не активны (как у мух, характеризующихся фенотипом XY; см. гл. 21), то транскрипт гена doublesex проходит процессинг способом, специфичным для самцов, и образуются самцы. Если эта гипотеза правильна, то дифференциальный процессинг РНК играет исключительно важную роль на протяжении всего индивидуального развития.

Дополнительные сведения и гипотезы: Биохимия процессинга РНК

Как осуществляется сплайсинг предшественников мРНК? Каким образом из одного предшественника могут возникать различные мРНК? Изучение биохимии процессинга РНК началось сравнительно недавно, поэтому в настоящее время мы не можем полностью прояснить эту довольно малоизученную область. Двумя наиболее важными открытиями за последние несколько лет явились обнаружение разветвленных промежуточных продуктов РНК и идентификация каталитических рибонуклеопротеидных частиц внутри ядра.

Сайты сплайсинга

Сравнение последовательностей ДНК большого числа различных генов выявило определенное сходство в местах соединения интронов и экзонов. Последовательность оснований интрона обычно начинается с ГT, а последовательность оснований экзона обычно оканчивается на АГ (табл. 13.3). Фактически «консенсусная последовательность» для 5'-концов нитронов – АГ/ГТ (т.е. большинство экзонов оканчивается на АГ, а интрон начинается с ГТ), а 3'-концевая последовательность большинства интронов ΊΤΝЦΑΓ (где N может быть любым нуклеотидом). Эти сайты оказываются очень важными для процессинга интрона. Болезнь ß-талассемия характеризуется генетической недостаточностью продукции βглобинов. При этом мутации возникают не в экзонах, кодирующих глобиновый белок, а в интронах. В случае одной из таких мутаций, приводящих к талассемии, последовательность ТТГГТЦТ в первом интроне изменена на ТТАГТЦТ. Обычный 3'-концевой сайт сплайсинга для этого интрона ТТАГ/ГЦТ. Поэтому данная мутация создает искусственный сайт сплайсинга, благодаря чему появляется возможность для ошибочного сплайсинга (Spritz et al., 1981). На самом деле ß-глобиновый предшественник при талассемии претерпевает сплайсинг в неправильных местах с вероятностью выше 90% (Busslinger et al., 1981).

Сайты разветвления

Помимо сайтов сплайсинга существует еще одна последовательность, необходимая для правильного вырезания нитронов. Это сайт разветвления. Он расположен внутри интрона обычно на расстоянии около 20–50 нуклеотидов выше 3'-концевого сайта сплайсинга и имеет консенсусную последовательность УАУААЦ. В большинстве положений У может быть заменен на Ц, а А – на Г. Однако предпоследний (подчеркнутый) остаток А является незаменимым. Этот остаток А имеет ключевое значение,

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ КОНТРОЛЬ РАЗВИТИЯ НА УРОВНЕ ПРОЦЕССИНГА РНК___________________________________ 191

Таблица 13.3. Последовательности нуклеотидов в местах соединения кодирующих областей и промежуточных последовательностей ¹⁾

Организм	Ген и интрон	Кодирующая последовательность	Промежуточная последовательность	Кодирующая последовательность.
Источник: Lewin, 1980. 1) Представлены последовательности ДНК, гомологичные последовательностям РНК, с совмещенными сайтами соединения экзонов и интронов. Точное место сплайсинга указать нельзя, так как последние основания первой кодирующей области обычно повторены на правом конце интрона. В конце таблицы приведены консенсусные последовательности, общие для большинства границ экзон/интрон (АГ/ГТ) и соединений интрон/экзон (ΤΤNЦАГ).

поскольку он образует фосфодиэфирное «разветвление» с фосфатом 5’-концевого сайта сплайсинга (рис. 13.15). Он делает это, используя свою свободную 2'-гидроксильную группу для соединения с фосфатом из 5’-сайта сплайсинга. Таким образом, фосфат из ГМФ, вместо того чтобы удерживать первый экзон, высвобождает его и зацепляется за 2’-гидроксильную группу АМФ в сайте разветвления. В результате этого маневра высвобождается первый экзон и образуется «лариатная» (типа лассо) структура в качестве промежуточной.

Свободный 3'-ОН-конец первого экзона присоединяется затем к фосфату в 3'-сайте сплайсинга ниже петли лариата, благодаря чему первый экзон заменяет собой интрон. В результате происходит соединение двух экзонов с помощью группы АГ из первого экзона и Г из второго экзона (Sharp, 1987).

Промежуточный продукт, напоминающий по форме лассо, с 2'—5' фосфодиэфирной связью был обнаружен в опытах с клонированным фрагментом ß-глобинового гена человека, состоящим из первых двух экзонов и интрона между ними (Ruskin et al., 1984). РНК, транскрибированную с этого клона, добавляли в экстракт ядер из клеток человека, способный осуществлять сплайсинг этого «предшественника» по соответствующим сайтам (Krainer et al., 1984). Для завершения этой реакции in vitro требуется около часа, после чего можно изолировать промежуточные продукты с помощью гель-электрофореза (поскольку лариатная структура затрудняет миграцию при электрофорезе). Химический анализ этих промежуточных продуктов подтвердил, что нуклеотид А в сайте разветвления имеет две фосфодиэфирные связи, одну с участием 2-ОН-группы и одну с участием 3'-ОН-группы. Вскоре после этого были идентифицированы аналогичные промежуточные продукты ß-глобиновых транскриптов при процессинге in vivo в зародышах кролика (Zeitlin, Efstratiadis, 1984).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: