Сделай Сам Свою Работу на 5

Контроль развития на уровне процессинга яРНК

Из предыдущего раздела мы узнали, что в геноме транскрибируется намного больше последовательностей по сравнению с теми, которые становятся мРНК. Этот вывод предполагает, что контроль дифференцировки может эффективно осуществляться после транскрипции путем дифференциального процессинга предшественников специфических мРНК. Недавние исследования на морском еже и крысе подтвердили это.

Из клеток бластулы морского ежа была получена уникальная ДНК с помощью денатурации ДНК и выделения фракции, которая не реассоциировала при значении С0t, равном 200 (Kleene, Humphreys, 1977). Ядерная РНК из клеток бластулы связывала 15% этой ДНК. Сходным образом яРНК со стадии плутеуса также связывала только 15% этой ДНК, даже если ее добавляли в большом избытке. Поскольку только одна цепь ДНК комплементарна РНК, 15% гибридизованной ДНК соответствуют 30% генома. Следовательно, около 30% генома активно транскрибируют яРНК на стадии бластулы и около 30% генома активно транскрибируют яРНК на стадии плутеуса. Одинаковы ли эти два набора последовательностей ДНК? Ответ на этот вопрос был получен в опытах, в которых ядерные РНК со стадий бластулы и плутеуса смешивали и затем добавляли их смесь к денатурированной уникальной ДНК. Если эти последовательности отличаются полностью, то следует ожидать, что свяжется 30% ДНК (т.е. 60% генома будут кодировать совместный набор мРНК для бластулы и плутеуса). Если они идентичны, то следует ожидать, что свяжется 15% ДНК. Полученные результаты представлены на рис. 13.4. Смесь связывала только 15% ДНК. Последовательности яРНК бластулы и плутеуса присоединялись к одной и той же ДНК. В пределах ошибки эксперимента можно считать, что популяции яРНК в клетках бластулы и плутеуса идентичны.


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

___________ КОНТРОЛЬ РАЗВИТИЯ НА УРОВНЕ ПРОЦЕССИНГА РНК_______________________________ 181

Рис. 13.4.Гибридизация ядерной РНК с уникальной [3Н]-ДНК. Радиоактивную уникальную ДНК смешивали с РНК бластулы. РНК плутеуса или со смесью РНК бластулы и плутеуса. Смеси инкубировали в условиях, обеспечивающих гибридизацию всех комплементарных последовательностей. Во всех трех случаях с РНК гибридизовалось около 15% ДНК. (По Kleene, Humphreys, 1977.) Рис. 13.5. Гибридизация «плутеус-плюс» ДНК и «плутеус-нуль» ДНК с РНК плутеуса и бластулы. А. РНК плутеуса и РНК бластулы связывают одинаковые количества «плутеус-плюс» ДНК. Б. Ни одна из этих РНК не связывает существенного количества «плутеус-нуль» ДНК. (По Kleene, Humphreys, 1977.)

 



Чтобы проверить это неожиданное наблюдение, те же исследователи (Kleene, Humphreys, 1977, 1985) выделили радиоактивную уникальную ДНК и смешали ее с РНК бластулы или плутеуса при высоком значении С0t (чтобы все последовательности ДНК могли присоединить РНК в случае, если комплементарные к ним последовательности РНК имелись в реакции). Затем они выделили те фрагменты ДНК, которые не связались с яРНК бластулы (бластула-нуль-ДНК), и те фрагменты ДНК, которые не связались с яРНК плутеуса (плутеус-нуль-ДНК). Когда бластула-нуль-ДНК денатурировали и смешали с новыми порциями яРНК плутеуса и когда плутеус-нуль-ДНК смешали с яРНК бластулы, гибридизации выше фоновых значений не наблюдалось (рис. 13.5). Таким образом, последовательности ДНК, транскрибируемые на стадии бластулы, действительно идентичны последовательностям ДНК, транскрибируемым на стадии плутеуса.

Некоторые наиболее убедительные данные, свидетельствующие о контроле за развитием на уровне процессинга, были получены в лаборатории Э. Дэвидсона и Р. Бриттена. Эти авторы впервые обнаружили, что у морского ежа Strongylocentrotus purpuratus в ходе развития сложность мРНК прогрессивно уменьшается (Galau et al., 1976), мРНК ооцита связывает приблизительно 4,5% генома и имеет сложность (измеренную по С0t) около 37 000 000 оснований. При средней длине мРНК в 2000 оснований это соответствует приблизительно 18 500 различным видам информационных РНК. мРНК бластулы связывает только 3,1% генома и представляет около 13 000 видов мРНК, а мРНК гаструлы связывает всего лишь 2,0% ДНК и имеет 8000 видов мРНК. После завершения дифференцировки тканей каждая из них содержит около 6000 видов мРНК, которые гибридизуются только с 0,75% генома (рис. 13.6). Таким образом, часть генома, которая экспрессируется в цитоплазматическую мРНК, постепенно уменьшается.

Следующий вопрос, которым задались исследователи: не вызвано ли такое уменьшение изменениями в транскрипции генома? Другими словами, не уменьшается ли сходным образом разнообразие яРНК? Для ответа на этот вопрос была выделена мРНК бластулы, которую гибридизовали с денатурированной радиоактивной ДНК (Wold et al., 1978).


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

182_______________ ГЛАВА 13_____________________________________________________________________________

Рис. 13.6. Наборы структурных генов, представленные своими мРНК, в различных тканях морского ежа. Закрашенная часть каждого столбца соответствует фракции мPHK данной ткани, которая идентична мРНК гаструлы. Незакрашенная часть столбца соответствует фракции мРНК, которая отличается от мРНК гаструлы. Сложность указана на оси ординат тремя различными способами: горизонтальная черта соответствует 100% сложности мРНК гаструлы. (По Galau et al., 1976.) Рис. 13.7. Специфичность мДНК бластулы ν морского ежа. Гибридизация мДНК (кДНК для мРНК бластулы) с мРНК бластулы и цитоплазматической РНК кишечника. (По Wold et al., 1978.)

 

Рис. 13.8. Идентичность (в пределах точности экспериментов) ядерной РНК из дифференцированных тканей морского ежа. А. Гибридизация мДНК бластулы с ядерной РНК кишечника, целомоцитов и гаструлы. Смеси для гибридизации инкубировали при значениях С0t достаточно высоких, чтобы обеспечить спаривание всех комплементарных последовательностей. Все последовательности бластулы были обнаружены в каждой популяции ядерных РНК, но не среди цитоплазматических РНК (рис. 13.7). Б. Схематическое изображение модели, основанной на дифференциальном процессинге РНК. В клетках обоих типов транскрибируются одинаковые наборы РНК (a, b, с, d, е), но процессинг в цитоплазму в клетках одного типа проходят последовательности c, d и e, а в клетках другого типа последовательности a, b и c. (А – из Wold et al., 1978.)

 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ КОНТРОЛЬ РАЗВИТИЯ НА УРОВНЕ ПРОЦЕССИНГА РНК____________________________ 183

 

Таблица 13.2. Сравнение тканей по последовательностям структурных генов, представленным в мРНК и яРНК
Источник кДНК-зонда Нормированная реакция с гомологичной мРНК Нормированная реакция с гетерологичной мРНК Нормированная реакция с яРНК
 
  мРНК % мРНК % яРНК %
Морской еж            
мРНК бластулы            
(уникальная ДНК) Бластула Кишечник Кишечник
      Целомоциты Целомоциты
Мышь            
мРНК мозга            
(общая кДНК) Мозг Почки Почки
мРНК мозга            
(кДНК. представ-            
ляющая редкие            
мРНК) Мозг Почки S6 Почки
Источник: Davidson, Britten, 1979.

Полученные гибриды элюировали, денатурировали и отделили ДНК от связавшейся с ней РНК. Таким способом был получен ДНК-зонд, который узнает последовательности мРНК бластулы. Эта ДНК обладала высокой специфичностью в отношении последовательностей мРНК бластулы (рис. 13.7): около 78% такой «ДНК бластулы» могли связаться с мРНК бластулы, тогда как с мРНК кишечника взрослой особи могли связаться менее 10% этой ДНК.

Затем эту «мДНК бластулы» использовали для идентификации последовательностей мРНК бластулы в препаратах РНК из различных дифференцированных тканей. Полученные результаты представлены на рис. 13.8 и в табл. 13.2. Последовательности мРНК бластулы были обнаружены в РНК из всех трех использованных в эксперименте тканей взрослых особей. Около 80% мДНК бластулы гибридизовались с яРНК гаструлы, кишечника и целомоцитов. Таким образом, только 10% зонда, узнающего мРНК бластулы, будут взаимодействовать с мРНК кишечника, но около 80% этого зонда будут взаимодействовать с ядерной РНК кишечника. Поскольку контрольный опыт (гибридизация мДНК бластулы с мРНК бластулы) также дает величину 75–80%, выясняется, что все последовательности мРНК бластулы присутствуют среди транскриптов яРНК во всех ядрах клеток кишечника, целомоцитов и клеток гаструлы. несмотря на отсутствие этих мРНК в цитоплазме. Ядро транскрибирует специфические для бластулы последовательности даже в дифференцированных целомоцитах и клетках кишечника. Итак, представляется вероятным, что контроль экспрессии генов у морского ежа осуществляется преимущественно на уровне процессинга РНК. Помимо этого аналогичные эксперименты на крысах и мышах свидетельствуют о практически полной идентичности ядерных РНК из мозга, печени и почки (Chikaraishi et al., 1978).



©2015- 2019 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.