Результаты и их интерпретация

Положительный результат - субстрат меняется от розового цвета к красному.

Отрицательный результат - субстрат остается янтарного цвета до 10 дня инкубации.

Предосторожности

Иногда в янтарной жидкости появляется красный осадок. Это положительная реакция нейтрального красного, но отрицательный тест на гидролиз Твина 80. Положительный гидролиз регистрируют, когда вся жидкая среда меняет цвет от бледно-розового до красного.

В редких случаях во время инкубирования супернатант белеет. В этом случае тестирование необходимо повторить. В случае повторного посветления регистрируют отрицательный результат.

Пиразинамидаза

Принцип метода. Тест основан на способности M tuberculosis в течение 4-х дней дезаминировать пиразинамид до пиразиновой кислоты и аммония, что указывает на наличие пиразинамидазы. Это исследование помогает такжеотличить M marinum (положительный результат до 4 дней) от M kansasii (отрицательный результат), и ниацин-положительные штаммы M. bovis от M. tuberculosis и M avium комплекс. У M. bovis пиразинамидаза отрицательна и на 7 день, тогда как M. tuberculosis и M avium комплекс дают положительный результат уже на 4 день. Тест применяется как дополнительный для дифференциации M. tuberculosis от M. bovis.

Реактивы

Среда для субстрата

Растворяют 6,5 г основы среды Дюбуа (Dubos) в 1 л дистиллированной воды. Добавляют 0,1 г пиразинамида (его можно заменить пиразиновой кислотой в том же количестве), 2,0 г пируват натрия, и 15,0 г агара. Подогревают до растворения агара и разливают в пробирки по 5 мл. Автоклавируют в течение 15 минут при 121°С. Остужают до застывания в вертикальном положении. Хранят в холодильнике в течение нескольких месяцев.

1% сульфат аммонийного железа

Готовят 1% раствор сульфата аммонийного железа сразу перед использованием: к 0,1 г сульфата аммонийного железа добавляют 10 мл дистиллированной воды.

Контроли

В качестве положительного контроля используют M. avium комплекс.

В качестве отрицательного контроля используют засеянную пробирку с M.bovis или M.kansasii.

Методика

Добавляют на поверхность среды двух пробирок полную лопатку 2-3 недельной культуры микобактерий, инкубируют при 37°C.

Через 4 дня добавляют 1,0 мл свежеприготовленного 1% раствора сульфата аммонийного железа к исследуемой культуре, контролю стандарта цвета, положительному и отрицательному контролям.

Оставляют пробирки на 30 минут при комнатной температуре, затем регистрируют покраснение среды. Среда приобретает розовый цвет, что свидетельствует о ферментативном гидролизе пиразинамида до свободной кислоты. Цвет в исследуемой пробирке легко определить на белом фоне при комнатном освещении.

Для минимизации контаминации нестерильного раствора сульфата аммонийного железа пробирки с отрицательным результатом помещают на 4 часа в холодильник и проверяют цвет среды (покраснение).

Если на четвертый день результат отрицательный или сомнительный, повторяют тестирование со второй пробиркой. Если результат положительный, то вторую пробирку можно сбросить.

Результаты и их интерпретация

Положительный результат - розовый цвет агара.

Отрицательный результат - цвет агара не меняется. 7.2.1.7. Уреаза

Принцип метода.Способность культуры гидролизировать мочевину (с высвобождением аммиака) используется для идентификации скотохромогенных и нефотохромогенных микобактерий.

M. scrofulaceum, M. szulgai, M. flavescens, M. bovis, M. tuberculosis, и M. gastri дают положительный результат, тогда как M. avium комплекс, M. xenopi, M. terrae комплекс, M. gordonae - отрицательны.

Дисковый метод

Приготовление реактивов

Помещают в пробирку с дистиллированной водой диск с уреазой.

Контроли

В качестве положительного контроля используют M. scrofulaceum или M.fortuitum. Отрицательным контролем служит незасеянная пробирка или уреаза-негативная M.gordonae.

Методика

В пробирку с субстратом вносят полную лопатку 3-недельной исследуемой культуры, выросшей на яичной среде, инкубируют при 37°C. Результат учитывают через 1 час и до 3 дней.

Результаты и их интерпретация

Положительный результат- цвет субстрата меняется на красный (от светлого до вишневого)

Отрицательный результат - цвет бледно-розовый или не меняется

Качественный бактериологический уреазный тест

Приготовление реактивов

Растворяют в 1 л дистиллированной воды 1 г пептона, 1 г декстрозы, 5 г NaCI, 0.4 г KH₂P0₄, 20 г мочевины, 1 мл 1% раствора фенола красного, 0.1 мл Твин 80 (или 10% раствора Твин 80). Конечный рH доводят NaOH до 5,8±0,1. Раствор стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и разливают в стерильные пробирки по 1,5 мл. Хранение при 5°C до 2 месяцев.

Контроли

В качестве положительного контроля используется M. scrofulaceum или M. fortuitum.

Отрицательным контролем служит незасеянная пробирка или уреаза-негативная M.gordonae

Методика

Полную лопатку свежей культуры добавляют в мочевинный бульон, инкубируют при 37°C в присутствии CO_2. Результаты учитывают на 1, 3 и 7 день.

Результаты и их интерпретация

Положительный результат - цвет меняется с желтого до темно-розового или красного.

Отрицательный результат - цвет не меняется.Светло-розовый цвет субстрата регистрируется как сомнительный (или отрицательный) результат и требующий повторения исследования. Рекомендуется использовать стандарт цвета нитратредуктазного теста.

Культуральные методы идентификации микобактерий

Для идентификации микобактерий туберкулеза может быть использовано определение способности к росту при 37°С на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей паранитробензойную кислоту (ПНБ-тест) либо салициловокислый натрий, на выбор лаборатории.

Тест с паранитробензойной кислотой (ПНБ-тест)

Принцип метода.Паранитробензойная кислота оказывает ингибирующее действие на рост микобактерий туберкулеза.

Приготовление среды с паранитробензойной кислотой.

К 50 мг паранитробензойной кислоты добавляют 5 мл дистиллированной воды и примерно 20 капель (1,0 мл) 4% едкого натра до pH 8. После полного растворения ПНБ добавляют 2–3 капли 6% соляной кислоты, доводя pH до 7,0. Полученный раствор добавляют к 95 мл предварительно профильтрованной яичной среды, получая таким образом конечную концентрацию паранитробензойной кислоты в среде 500 мкг/мл. Свертывание среды производят при 85°С в течение 45 минут

Методика

Производят посев в две пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, одна из которых содержит паранитробензойную кислоту в концентрации 500 мкг/мл, другая – контрольная без паранитробензойной кислоты.

В процессе инкубации при 37°С пробирки исследуют на 3-й, 7-й, 14-й и 21-й день.

Результаты и их интерпретация

Положительный результат - наличие роста в контроле и на среде с ПНБ

Отрицательный результат - рост только в контроле.

Тест с салициловокислым натрием

Принцип метода. Микобактерии комплекса M. tuberculosis не обладают способностью утилизировать салициловокислый натрий, который оказывает на рост микобактерий туберкулеза угнетающее воздействие. Это свойство салицилата натрия используется как один из методов дифференциации M. tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий.

Приготовление среды с салициловокислым натрием

500 мг салициловокислого натрия растворяют в 5 мл дистиллированной воды, получая разведение 100000 мкг/мл. 1 мл полученного раствора добавляют к 99 мл среды Левенштейна-Йенсана до свертывания, получая таким образом конечную концентрацию салициловокислого натрия 1000 мкг/мл. Свертывание среды производят при 85°С в течение 45 минут

Методика

Производят посев в две пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, одна из которых содержит салициловокислый натрий в концентрации 1000 мкг/мл, другая – контрольная без салициловокислого натрия.

В процессе инкубации при 37°С пробирки исследуют на 3-й, 7-й, 14-й и 21-й день.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: