Результаты и их интерпретация

Отрицательный результат– окрашивания нет. Если раствор остается бесцветным, это означает, что результат теста отрицательный или что процесс восстановления прошел слишком быстро, при этом нитриты восстановились до нитридов. Для того чтобы убедиться в истинности результата, необходимо добавить в пробирку немного порошка цинка (небольшой объем порошка цинка переносят из флакона на кончике слегка увлажненного аппликатора).

а) Если в растворе остался нитрат, цинк катализирует реакцию и появится красное окрашивание, что свидетельствует об истинно отрицательном результате теста.

б) Если после добавления порошка цинка красного окрашивания раствора не произошло, это означает, что результат теста положителен, но процесс восстановления прошел стадию нитрита.

Тест повторяют, чтобы подтвердить его результат.

Положительный результат: красное окрашивание (оттенки от розового до темно-красного)

Градации интенсивности окраски:

Бледно-розовый – +/-

Розовый – 1+

Темно-розовый – 2+

Красный – 3+

Темно-красный – 4+

Пурпурно-красный – 5+

Результат считают положительным только в тех случаях, когда интенсивность окраски составляет от 3+ до 5+.

Модифицированный метод с использованием бумажных полосок

Для определения способности бактерий редуцировать нитраты можно использовать коммерческие бумажные полоски. При использовании данной модификации нитратредуктазного теста надежные результаты получаются в тех случаях, когда микобактерии интенсивно редуцируют нитраты (например, M. tuberculosis). Поэтому при идентификации микобактерий туберкулеза этот метод дает вполне приемлемые результаты и позволяет сократить трудозатраты, хотя стоимость бумажных полосок значительно выше.

Методика

1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия вносят в пробирку с завинчивающейся крышкой, с помощью бактериологической лопатки суспендируют в этом растворе четырехнедельную культуру микобактерий в объеме 2-х лопаток.

С помощью стерильного пинцета аккуратно вносят в пробирку бумажную полоску для нитратредуктазного теста; при этом не допускается увлажнение полоски каплями жидкости на стенках пробирки.

Тщательно закрывают крышку и оставляют пробирку в вертикальном положении на 2 часа при температуре 37°С. После первого часа инкубации осторожно встряхивают пробирку, не наклоняя ее и не переворачивая. После двух часов инкубации пробирку шестикратно наклоняют, чтобы индикаторная полоска смочилась полностью. Оставляют пробирку на 10 минут в наклонном положении, чтобы жидкость покрывала всю полоску.

Появление красного окрашивания в верхней части полоски означает положительный результат теста.

Результаты и их интерпретация

Отрицательный результат – отсутствие окрашивания.

Положительный результат – верхняя часть полоски приобретает красный цвет (оттенок от розового до темно-красного).

Предосторожности

Перед проведением теста необходимо убедиться, что срок годности коммерческих тест-полосок не истек.

Полоски чувствительны к солнечному свету, а также к повышенной температуре и влажности, поэтому их следует хранить в оригинальной упаковке в непрозрачном контейнере с крышкой при температуре 2–8°С.

Не следует использовать обесцвеченные полоски. Если полоски обесцветились, они подлежат уничтожению, так как произошло снижение активности реагента.

Результаты следует расценивать как сомнительные, если в положительном контроле получены слабоположительные или отрицательные результаты.

Стандарты для нитратредуктазного теста

Чтобы обеспечить унификацию положительных результатов теста по выявлению способности микобактерий восстанавливать нитраты, рекомендуется использовать заранее приготовленную серию стандартов, соответствующих различной активности нитратредуктазы. Активность этой ферментной системы выражается в интенсивности окраски – от "+/–" до "5+" (см. выше). Эти стандарты можно хранить неопределенно долго и использовать при каждой постановке нитратредуктазного теста.

Реагенты

Растворы:

1. 0,067 М раствор фосфата натрия двузамещенного (9,47 г безводного Na₂HPO₄ на 1000 мл воды)

2. 0,067 М раствор фосфата калия однозамещенного (9,07 г КН₂PO₄ на 1000 мл воды)

3. 0,067 М раствор фосфата натрия трехзамещенного (25,47 г Na₃PO₄ •12 Н₂О на 1000 мл воды)

4. 1% спиртовой раствор фенолфталеина (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)

5. 1% спиртовой раствор бромтимолового синего (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)

6. 0,01% раствор бромтимолового синего: 1,0 мл 1% раствора бромтимолового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Рабочий буферный раствор: Смешивают 35 мл раствора №1, 5 мл раствора №2 и 100 мл раствора №3.

Методика

В штатив ставят 8 чистых пробирок (пробирки №№ 1 -8).

Вносят 2 мл рабочего буферного раствора в 7 пробирок (с №2 до №8).

К 10 мл рабочего буферного раствора добавляют 0,1 мл раствора №4 и 0,2 мл раствора №6.

Вносят 2 мл раствора №7 в пробирку №1. Это цветовой стандарт, соответствующий реакции максимальной интенсивности ("5+").

В пробирку №2 вносят 2 мл раствора №7, хорошо перемешивают и переносят 2 мл в следующую пробирку (№3).

Продолжают серию двукратных разведений вплоть до пробирки №8, из которой выливают 2 мл смеси.

В результате будут получены следующие цветовые стандарты:

пробирка №1 – 5+

пробирка №2 – 4+

пробирка №3 – 3+

пробирка №5 – 2+

пробирка №6 – 1+

пробирка №8 – +/-

Пробирки автоклавируют, закрывают их герметично и хранят при 5°С.

Каталазный тест

Принцип метода. Каталаза – это внутриклеточный растворимый фермент, который способен расщеплять перекись водорода на воду и кислород, т.е. обеспечивать следующую химическую реакцию: 2Н₂О₂ = 2Н₂О + О₂. При этом в реагирующей смеси образуются пузырьки кислорода, что указывает на наличие каталазной активности. Почти все виды микобактерий обладают каталазной активностью, за исключением M. bovis и некоторых резистентных к изониазиду штаммов M. tuberculosis.

В клетках микобактерий присутствует ряд изоферментов каталазы, различающихся по термостабильности. Необходимо отметить, что нетуберкулезные микобактерии и некоторые сапрофиты синтезируют термостабильную каталазу.

При изучении каталазной активности микобактерий используют как качественные, так и количественные тесты:

- качественный (капельный) тест, указывающий на наличие каталазы (выполняется при комнатной температуре);

- полуколичественный тест, указывающий на уровень каталазной активности (измеряется высотой столбика пузырьков в пробирке);

- тест на термостабильность каталазы – тест определения наличия каталазы при 68°С и рН 7,0.

Чувствительные к противотуберкулезным препаратам штаммы M. tuberculosis продуцируют каталазу, активность которой можно определить капельным методом. При постановке полуколичественного теста столбик пузырьков газа не превышает 45 мм. После прогревания бактерий при 68°С и рН 7,0 в течение 20 минут микобактерии комплекса M. tuberculosis дают отрицательный результат.

Для постановки каталазных тестов следует использовать двухнедельные культуры, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена при 35–37°С. Для выполнения указанных тестов пробирки с питательной средой помещают в свертыватель для коагуляции в вертикальном положении. При инкубации в стандартных условиях пробирки должны быть закрыты пробками. Продолжительность инкубации - 14 дней.

Реактивы

0,067 М фосфатный буферный раствор, pH 7,0

Раствор1: Растворяют навеску Na₂НРО₄ 9,47 г в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы получить 0,067 М раствор.

Раствор 2: Растворяют навеску КН₂РО₄ 9,07 г в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы получить 0,067 М раствор.

Для получения 0,067 М фосфатного буфера смешивают 611 мл раствора 1 и 389 мл раствора 2.

Перекись водорода, 30%

При постановке теста используют 30% раствор перекиси водорода, а не 3% раствор, который обычно получают из аптек. 30% раствор перекиси водорода (Н₂О₂) хранят в холодильнике.

При работе с раствором используют резиновые перчатки и защитный щиток для глаз.

Твин 80, 10%

Смешивают 10 мл Твин 80 с 90 мл дистиллированной воды и автоклавируют при 121°С в течение 10 минут. В процессе автоклавирования Твин 80 может образовать осадок, который можно растворить при покачивании флакона сразу же после автоклавирования или в процессе охлаждения. Готовый раствор хранят в холодильнике.

Готовый каталазный реагент (смесь Твина 80 с перекисью водорода)

Непосредственно перед постановкой теста смешивают равные объемы 10% раствора Твина 80 и 30% раствора перекиси водорода. Для исследования каждого штамма требуется 1,0 мл каталазного реагента.

Контроли:

Капельный метод

В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля - пробирку с референс-штаммом M. tuberculosis H₃₇Rv, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.

Полуколичественный метод и тест на термостабильность каталазы при 68°С

В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля – пробирку с референс-штаммом M. terrae, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.

Методика:

Капельный метод

Для постановки теста используют двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена. В пробирку с ростом микобактерий добавляют 1–2 капли свежеприготовленной смеси Твина 80 с перекисью водорода (готовый каталазный реагент). Наблюдают в течение 5 минут, происходит ли образование пузырьков газа.

Результаты и их интерпретация:

Отрицательный результат - пузырьки газа не образуются

Положительный (медленный) результат - небольшое количество медленно образующихся пузырьков газа

Положительный (быстрый) результат - немедленное образование большого количества пузырьков газа

Полуколичественный метод

Для постановки теста используют двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена. В пробирку с ростом микобактерий добавляют 1 мл свежеприготовленной смеси твина-80 с перекисью водорода, плотно закрывают пробирку и оставляют на 5 минут при комнатной температуре. В пробирке образуется столбик пены.

Измеряют высоту этого столбика от уровня жидкости в пробирке до верхнего края пены

Результаты и их интерпретация:

Каталазная активность слабая или отсутствует - высота столбика пены менее 31 мм

Неопределенный результат - высота столбика пены от 31 мм до 45 мм

Высокая каталазная активность - высота столбика пены более 45 мм

7.2.1.4. Тест на термостабильность каталазы при 68°С и рН 7,0

Методика:

С помощью стерильной пипетки вносят с соблюдением правил асептики 0,5 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0) в пробирку размерами 16х125 мм с завинчивающейся крышкой. С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки суспендируют в этом растворе исследуемую культуру микобактерий (использовать несколько петель биомассы).

Пробирки с бактериальными суспензиями помещают в предварительно нагретую водяную баню на 20 минут при температуре 68°С; температура и продолжительность инкубации имеют чрезвычайно важное значение.

Достают пробирки из водяной бани и оставляют при комнатной температуре до полного остывания.

Вносят в каждую пробирку 0,5 мл свежеприготовленной смеси Твина 80 с перекисью водорода и плотно закрывают пробки. Наблюдают за образованием пузырьков, появляющихся на поверхности жидкости. Нельзя встряхивать пробирку, так как при этом Твин 80 спонтанно образовывает пузырьки, что может стать причиной ложноположительного результата.

Пробирки с отрицательными результатами нельзя сбрасывать раньше, чем через 20 минут.

Результаты и их интерпретация:

Положительный результат - пузырьки газа образуются

Отрицательный результат - пузырьков газа нет

В редких случаях может наблюдаться небольшое количество пузырьков, поднимающихся от осадка бактериальных клеток; при этом пена в пробирке не образуется. В таких случаях результаты каталазного теста также считают положительными.

Гидролиз Твин 80

Принцип метода.Ферментативный гидролиз Твин 80 используется для определения потенциально патогенных видов (негативная реакция) от медленнорастущих скотохромогенных и нефотохромогенных сапрофитов (положительная реакция). Среда для исследования включает в себя Твин 80 и индикатор нейтральный красный (pH 7). В обычных условиях при pH 7 нейтральный красный красного цвета, но когда он связывается с липидами или Твин 80, индикатор становится янтарного или соломенного цвета, что показывает сдвиг pH в щелочную сторону. При энзимном гидролизе Твин 80 происходит освобождение нейтрального красного, и окраска восстанавливается от розовой до красной.

Реактивы

Фосфатный буфер, pH 7

a) Na₂HPO₄, 0067 М

Растворяют 9,47 г Na₂HPO₄ безводного в 1 л дистиллированной воды.

b) KH₂PO_4, 0,067 М

Растворяют 9,07 г KH₂PO₄ в 1 л дистиллированной воды.

Для приготовления 100 мл буферного раствора к 61,1 мл раствора «а» добавляют 38,9 мл раствора «b» и проверяют pH полученного раствора.

Субстрат среды

К 100 мл фосфатного буфера добавляют 0,5 мл Твин 80 и 2 мл 0,1 % водного раствора нейтрального красного. Полученный субстрат разливают в пробирки по 2 мл. Автоклавируют 10 минут при 121°C. После автоклавирования субстрат должен быть янтарного или соломенного цвета. Хранят в темном месте при 5°C не более 2 недель.

Контроли

Положительным контролем служит пробирка, засеянная M. kansasii.

Отрицательным контролем служит пробирка, засеянная M. bovis (BCG) или M. avium комплекс. В качестве отрицательного контроля можно использовать незасеянный субстрат.

Методика

Полную лопатку исследуемых микроорганизмов инокулировать в субстрат, инкубируют при 37°C.

Результаты учитывают на 1, 5 и 10 дни инкубирования. Регистрируют, на какой день цвет поменялся на розовый или красный. Не трясти пробирки при просмотре.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: