СТАНДАРТНЫЕ МЕТОДЫ РАЗЖИЖЕНИЯ И ДЕКОНТАМИНАЦИИ

Тщательная регистрация всех получаемых клинических проб, «движения» каждой пробы в лаборатории, результатов лабораторных исследований и проб, направленных в вышестоящие или региональные лаборатории для культурального исследования и определения лекарственной устойчивости возбудителей, является необходимой. Стандартные записи должны быть простыми, иметь практическое значение и фиксировать только основную информацию, все данные должны быть унифицированы и достоверны.

Поступивший в лабораторию материал перед обработкой и посевом должен быть зарегистрирован в лабораторном регистрационном журнале. Этот журнал заполняется лаборантом бактериологической лаборатории, проводящей бактериоскопическое исследование и/или культуральное исследование мокроты. В журнал регистрации лабораторных исследований должны быть внесены необходимые данные о каждом больном. Каждой пробе материала необходимо присвоить порядковый регистрационный лабораторный номер, который должен использоваться при всех последующих лабораторных исследованиях. Во время еженедельных просмотров посевов в журнал вносят сведения о дате появления видимого роста микобактерий, номер культуры микобактерий по журналу регистрации выделенных культур микобктерий, контаминации посевов неспецифической микрофлорой, отсутствии роста в течение 10 недель инкубации. После завершения идентификации выделенных культур микобактерий в журнале указывают результат бактериологического исследования, дату выдачи ответа. Образец журнала регистрации лабораторных исследований на туберкулез приведен в приложении 2.

Особенностью M.tuberculosis является способность их долгое время находиться в жидкостях во взвешенном состоянии, поэтому все жидкие материалы подлежат обязательному центрифугированию. Все последующие манипуляции выполняют с полученным осадком.

Перед посевом исследуемый материал необходимо гомогенизировать и освободить от контаминирующей микрофлоры. Для этого мокроту, экссудаты и другой негомогенный материал собирают в стерильные флаконы, добавляют щелочь или кислоту и подвергают встряхиванию. Процедура предпосевной обработки должна быть максимально щадящей, обеспечивающей частоту контаминации, не превышающую 5%. Режим центрифугирования должен обеспечивать осаждение 95% клеток микобактерий с минимальной гибелью их вследствие нагревания.

Для использования в практике приемлем любой метод предпосевной обработки материала, при использовании которого частота контаминации находится в пределах 2-5%. Интенсивность контаминации проб может варьировать в значительной степени, поэтому необходимо выбирать способ деконтаминации соответственно исследуемому материалу. Выбор метода деконтаминации зависит также от того, как давно была взята проба, и в каких условиях она хранилась и транспортировалась в лабораторию.

Если возникают сомнения в контаминации образцов, можно провести посев части пробы без какой-либо предварительной обработки на неселективную питательную среду (например, на простой питательный агар) и инкубировать в течение 24 часов для того, чтобы проконтролировать наличие в образце контаминирующих бактерий. Остальную часть пробы хранят без какой-либо обработки в холодильнике до тех пор, пока не будет подтверждено отсутствие контаминирующих бактерий. Если при этом будет установлен факт контаминации, оставшуюся часть пробы можно деконтаминировать одним из описанных ниже методов.

Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки диагностических материалов, должны иметь степень очистки не менее категории "химически чистый" (ХЧ). Для предпосевной обработки диагностического материала используют только стерильные растворы детергентов, щелочей и кислот.

Для обработки и посева материала используют только стерильную посуду (баночки, центрифужные пробирки, пипетки и т.д.). В случае обработки материала с использованием нескольких растворов каждый раствор добавляют новой стерильной пипеткой.

Надосадочную жидкость, полученную в результате центрифугирования, отбирают стерильной пипеткой и переносят в контейнер с дезраствором. Запрещается перенос материала путем переливания его через край флаконов, пробирок. Использованные пипетки помещают в емкость с дезинфицирующим раствором.

Обработка мокроты

4.1.1. Обработка 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na₃PO₄) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2–3-х-дневном хранении материала при +4°С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.

Обработку материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия производят следующим образом:

Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе, заливают равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия и помещают на 10 мин во встряхиватель, затем на 18–20 часов – в термостат при 37°C. После этого материал центрифугируют при 3000g в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

Надосадочную жидкость отбирают, осадок отмывают 10–15 мл изотонического раствора NaCl или дистиллированной воды.

Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8–1,0 мл засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

Реактивы.

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na₃PO₄)

Кислота соляная (HCl) концентрированная;

Бумага индикаторная универсальная.

Приготовление растворов.

1. 10% раствор трехзамещенного фосфата натрия. 100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяют в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до 1 л.

2. 6% соляная кислота. 6 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 94 мл дистиллированной воды. Никогда не добавлять воду в кислоту!

Растворы стерилизуют в течение 20 мин при 1 атм.

4.1.2. Обработка 3% серной кислотой

 

Длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты губительно действует на микобактерии, поэтому общее время обработки кислотой не должно превышать 20 минут.Раствором серной кислоты можно производить также обработку материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры: мочи, гнойных экссудатов и отделяемого ран, резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр.

Обработку материала 3% серной кислотойпроизводят следующим образом:

К исследуемому материалу добавляют равный объем 3% раствора серной кислоты, перемешивают, выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре, не превышая время экспозиции.

Пробу центрифугируют при 3000g в течение 10 мин, не превышая время экспозиции. Надосадочную жидкость отбирают, к осадку добавляют 15 мл стерильного 0,9% раствора хлористого натрия. Пробирки повторно центрифугируют при 3000g в течение 15 мин.

Надосадочную жидкость отбирают, к осадку добавляют 1–2 капли 4% едкого натра до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

Осадок в объеме 0,8–1,0 мл засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

 

Реактивы:

Серная кислота (H₂SO₄) концентрированная;

Едкий натр (NaOH).

 

Приготовление растворов

1. 3% раствор серной кислоты.К 97 мл дистиллированной воды добавляют 3 мл концентрированной серной кислоты, осторожно наслаивая ее по стенкам сосуда. Никогда не добавлять воду в кислоту! Нельзя пипетировать концентрированную серную кислоту ртом!

2. 4% раствор едкого натра.40 г NaOH заливают дистиллированной водой до объема 1л.

Растворы стерилизуют в течение 20 мин при 1 атм.

4.1.3. Обработка 4% раствором едкого натра (модифицированный метод Петрова)

 

Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к гибели до 60% микобактерий, содержащихся в исследуемом образце материала, поэтому общее время обработки материала щелочью не должно превышать 40 минут.Данный показатель не зависит от дополнительной гибели бактерий за счет повышенной температуры при центрифугировании и других факторов. Поэтому при использовании данного метода необходимо строго соблюдать указанное время обработки.

Обработку материала 4% раствором едкого натра производят следующим образом:

Исследуемый материал заливают двойным объемом 4% раствора едкого натра и помещают на 10 мин во встряхиватель, затем выдерживают 15 мин при комнатной температуре с периодическим ручным встряхиванием, не превышая время экспозиции. После этого материал центрифугируют при 3000g в течение 15 мин.

Надосадочную жидкость отбирают, к осадку добавляют 15 мл стерильного 0,9% раствора хлористого натрия, пробы центрифугируют при 3000g в течение 15 мин.

Надосадочную жидкость отбирают, к осадку добавляют 1–2 капли 10% раствора соляной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

Осадок в объеме 0,8-1,0 мл засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

 

Реактивы.

Едкий натр (NaOH);

Кислота соляная (HCl) концентрированная;

 

Приготовление растворов.

1. 4% раствор едкого натра.К40 г едкого натра добавляют дистиллированную воду до объема 1 л.

2. 10% раствор соляной кислоты. 10 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 90 мл дистиллированной воды.

Растворы стерилизуют в течение 20 мин при 1 атм.

 

Предыдущая123456789101112Следующая

---

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:

©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.