Альтернативные методы обработки диагностического материала

Обработка с использованием N-ацетил-l-цистеина и гидроокиси натрия (NALC-NаOH).

Применение муколитического препарата N-ацетил-L-цистеина (NALC), используемого для быстрого разжижения мокроты, позволяет снизить концентрацию деконтаминирующего вещества (NaOH) до конечной концентрации 1% при смешивании с пробой. Этот метод повышает высеваемость микобактерий, однако требует больше затрат времени и средств. Ацетилцистеин в растворе быстро теряет активность, поэтому раствор нужно готовить ежедневно. Цитрат натрия включен в литическую смесь для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и инактивировать действие N-ацетил-L-цистеина.

Обработку материала NALC-NаOH производят следующим образом:

К 10 мл или меньше диагностического материала добавляют равный объем раствора NALC-NаOH, встряхивают в течение 10-20 секунд для перемешивания пробы, затем оставляют на 15 минут при комнатной температуре. Если необходима более эффективная деконтаминация, можно повысить концентрацию NaOH до 5–6%, не увеличивая время экспозиции пробы с деконтаминирующим раствором.

После 15-минутной экспозиции доводят объем пробы до 50 мл дистиллированной водой, перемешивают и центрифугируют при 3000g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбирают. Осадок немедленно засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

Реактивы

NаOH.

Цитрат натрия

N-ацетил-l-цистеин

Приготовление растворов.

1. 4% NаOH. Добавляют 4 г NаOH к 100 мл дистиллированной воды.

2. 2,9% цитрат натрия. Добавляют 2,9 г цитрата натрия к 100 мл дистиллированной воды.

3. 4% NаOH+2,9% цитрат Nа. Смешивают 25 мл 4% раствора NаOH и 25 мл 2,9% раствора цитрата натрия. Этот раствор после стерилизации можно хранить для дальнейшего использования.

4. NALC-NаOH. 0,25 г. N-ацетил-l-цистеина добавляют к 50 л раствора 4% NаOH+2,9% цитрат Nа. После добавления N-ацетил-l-цистеина раствор необходимо использовать в течение 24 часов.

4.1.4.2. Обработка с использованием 5% щавелевой кислоты или 4% серной кислоты

В случаях чрезмерно высокой контаминации некоторых проб можно применить более жесткие методы деконтаминации с использованием 5% щавелевой кислоты или 4–6% серной кислоты. Эти методы нередко дают хорошие результаты в тех случаях, когда пробы мокроты оказываются массивно загрязненными Pseudomonas sp. и другими грамотрицательными микроорганизмами.

Обработка проводится аналогично методике обработки 3% раствором серной кислоты.

Обработка других видов диагностического материала

Промывные воды желудка

Исследование промывных вод желудка должно быть проведено в течение первых четырех часов после их получения от больного, так как из-за высокой кислотности микобактерии туберкулеза могут быстро погибнуть. Обычно при исследовании промывных вод желудка нет необходимости осуществлять деконтаминацию, если проба была взята в стерильный флакон с соблюдением правил асептики. Необходимо центрифугировать весь объем пробы при 3000g в течение 30 минут. Если предполагается контаминация пробы, осадок ресуспендируют в 2 мл 4%-й серной кислоты и оставляют на 15 минут, после чего к смеси добавляют 15 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Эту смесь центрифугируют при 3000g в течение 15 минут и нейтрализуют осадок 4%-м раствором NaOH до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской. Сразу же после этого материал засевают на питательную среду.

Моча

К пробе мочи добавляют равный объем 10% трехзамещенного фосфата натрия и помещают на 10 мин во встряхиватель, затем на 18 - 20 часов в термостат при 37°C. После этого материал центрифугируют при 3000g в течение 15 минут.

Надосадочную жидкость отбирают, осадок отмывают 10–15 мл изотонического раствора NaCl или дистиллированной воды.

Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8-1,0 мл засевают на питательную среду.

Носоглоточная слизь

В пробирку с тампоном добавляют 4–5 мл 10% трехзамещенного фосфата натрия и помещают на 10 мин во встряхиватель, затем на 18–20 часов в термостат при 37°C. После этого пробирку с тампоном центрифугируют при 3000g в течение 15 минут.

Надосадочную жидкость отбирают, осадок отмывают 10–15 мл изотонического раствора NaCl или дистиллированной воды.

Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8–1,0 мл засевают на питательную среду.

Ткани

Лимфатические узлы, биоптаты, ткани, резецированные во время хирургического вмешательства, необходимо измельчить с помощью стерильного скальпеля или ножниц. Затем образец гомогенизируют в стерильной фарфоровой ступке или в гомогенизаторе тканей, добавив 0,5–1,0 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и небольшое количество стерильного песка (при необходимости). Эту суспензию можно использовать для посева на питательную среду в тех случаях, если указанные выше манипуляции были проведены с соблюдением правил асептики. Если правила асептики не соблюдались, проводят деконтаминацию пробы 4%-м раствором серной кислоты, как это рекомендуется делать при обработке мочи.

Гной

Гной можно обрабатывать таким же образом, как и аспирированные жидкости. Если гной очень густой, его следует обрабатывать так же, как мокроту.

Спинномозговая жидкость

Стерильно взятую спинномозговую жидкость можно засевать без предварительной обработки. Если возможна контаминация спинномозговой жидкости, осадок смешивают с 2 мл 4%-й серной кислоты и оставляют на 15 минут. Затем к смеси добавляют 15 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, центрифугируют при 3000g в течение 15 минут и сразу же производят посев осадка на питательную среду.

Сгустки

Для предупреждения образования больших сгустков в плевральной или асцитической жидкости рекомендуется добавление цитрата натрия к биологическому материалу в момент его сбора. Для этого добавляют 2 капли 20%-го раствора цитрата натрия на каждые 10 мл собранной жидкости. Если сгусток все-таки образовался, его можно растворить с помощью щелочного метода Петрова.

Другие биологические жидкости (включая плевральную жидкость)

Слизисто-гнойные жидкости обрабатывают так же, как и мокроту, когда объем пробы составляет 10 мл или меньше.

Чистые жидкости. Если материал получен с соблюдением правил асептики, его центрифугируют при 3000g в течение 15 минут и сразу же производят посев осадка на питательную среду. Если объем пробы превышает 10 мл, её обрабатывают так же, как промывные воды желудка. Микобактерии туберкулеза могут «приклеиваться» к стеклу или пластику. Поэтому чтобы добиться максимального извлечения микобактерий, контейнер ополаскивают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, раствор центрифугируют при 3000g в течение 15 минут и производят посев 2–3 капель осадка на питательную среду.

Кровь и другие жидкие материалы с большой примесью крови после добавления 3% раствора лимоннокислого натрия центрифугируют при 3000g, и осадок 3 раза отмывают стерильной дистиллированной водой.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Бактериологическое исследование является обязательным этапом в диагностике туберкулеза. Для подтверждения диагноза туберкулез необходимо выделить культуру M.tuberculosis на искусственной питательной среде и идентифицировать ее, используя дифференциальные тесты in vitro .Для культивирования микобактерий туберкулеза было разработано множество различных питательных сред, которые делятся на три основные группы –яичные (плотные), агаровые (плотные и полужидкие) и жидкие (синтетические и полусинтетические). Идеальная среда для выделения микобактерий туберкулеза должна быть:

а) экономичной и простой в приготовлении, состоять из легкодоступных компонентов;

б) угнетать рост сопутствующей микрофлоры (контаминантов);

в) стимулировать рост микобактерий туберкулеза, содержащихся в исследуемом материале;

г) позволять осуществлять предварительную дифференциальную диагностику выделенных культур по морфологии колоний.

Для выделения микобактерий туберкулеза яичные среды являются средами выбора, так как именно они удовлетворяют всем требованиям, перечисленным выше. Рутинному использованию жидких сред при исследовании мокроты препятствует их более высокая стоимость. Однако при исследовании некоторых видов биологического материала жидкие питательные среды могут иметь преимущества. В тех случаях, когда получение повторного клинического образца может быть затруднительно или невозможно (например, при исследовании спинномозговой жидкости или биопсированных тканей), рекомендуется для выделения микобактерий туберкулеза одновременно использовать две среды – яичную и жидкую.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: