Выражение результатов биохимических исследований

Выбранная для исследования методика должна отличаться точностью, специфичностью и воспроизводимостью результатов.

В биохимии и клинической химии используются основные и про­изводные единицы СИ. Концентрацию веществ, молекулярная масса которых известна (например, концентрацию глюкозы, мочевины, мочевой кислоты в биологических жидкостях), выражают в единицах молярной концентрации моль/литр или в дольных единицах - миллимоль/литр, микромоль/литр.

Концентрацию веществ, у которых не установлена или точно не известна молекулярная масса, выражают в единицах массовой концентрации (или в массовых долях) -кг/л, г/л, мг/л, мкг/л и т.д. В этих же единицах вы­ражаются результаты определения содержания белков (альбумин, фибрино­ген, общий белок, гаптоглобин, общих липидов.).

Физико-химические методы в биохимии

Центрифугирование

Центрифугирование - метод разделения неоднородных систем, в том числе суспензий и растворов, в поле центробежных сил. В основе метода лежит следующий принцип: более крупные и более плотные частицы осаж­даются быстрее и собираются на дне пробирки. Рабочая часть центрифуги – ротор, в который помещают пробирки с исследуемой жидкостью.

Центрифужные пробирки перед центрифугированием уравновешивают и в роторе ставят друг против друга.

В лабораторной практике центрифугирование чаще всего применяют для:

1) отделения форменных элементов от плазмы крови;

2) разделения субклеточных частиц;

3) осаждения денатурированных белков.

В клинической биохимии наиболее часто используют центрифуги общего назначения, которые способны давать максимальную скорость до 6000 об/мин. Для получения субклеточных частиц используют скоростные и ультрацентрифуги. Ультрацентрифуги дают предельную скорость до 80 000 об/мин и центробежное ускорение до 500 000 g. Они снабжены холодильни­ком и вакуумной установкой.

Фотометрия

Ф о т о м е т р и я - метод количественного анализа, основанный на измерении интенсивности поглощения или рассеяния веще­ством светового потока.

Светопоглощение или э к с т и н к ц и я прямо пропорционально концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и коэффициенту молярной экстинкции. Коэффициент молярной экстинкции – величина поглощения, которую дает 1 моль вещества в 1 мл раствора при толщине слоя измеряемого раствора равной 1 см.

Экстинкция прямо пропорциональна интенсивности окраски раствора, которая может быть изначаль­ной (то есть определяемое вещество обусловливает цвет раствора), либо приобретенной в процессе химической реакции.

Концентрацию определяемого вещества можно рассчитать двумя способами:

1) используя экстинкцию стандартного раствора с известной концентрацией опре­деляемого вещества. Для этого составляют пропорцию:

Е_ст. соответствует С_ст.

Е_оп. -"- С_оп.

С_ст. х Е_оп.

откуда С_оп.= ;

Е_ст.

где Е_ст. - экстинкция стандартного раствора;

Е_оп. - экстинкция исследуемого раствора;

С_ст. - концентрация стандартного раствора;

С_оп. - концентрация определяемого вещества.

2) Концентрация исследуемого вещества определяется с помощью калибровочного графика. Для построения калибровочного графика изме­ряют экстинкции нескольких растворов с известной концентрацией опреде­ляемого вещества.

Фотометрические приборы делятся на две большие группы: фото­электроколориметры и спектрофотометры.

В фотоэлектроколориметрах нужные спектральные диапазоны вы­деляют при помощи светофильтров (красного, зеленого, синего, фиолето­вого и т.д.). В спектрофотометрах участки спектра выделяют при помощи призм или дифракционных решеток, поэтому можно установить любую длину волны в заданном диапазоне. Обычно спектрофотометры - это при­боры более высокого класса, чем фотометры - в них можно выделить более узкий участок (более монохроматический) спектра, следовательно, точность измерения будет выше. Однако, все зависит от конкретной конструкции прибора.

Чаще всего в клинической биохимии фотометрия проводится в области 400-700 нм – это, так называемая, видимая область спектра. Свет с большей длиной волны относится кближней инфракрасной области, измере­ния в которой приходится делать чрезвычайно редко. Свет с длиной волны короче 400 нм относится культрафиолетовому диапазону, причем, разли­чают ближнюю область с длиной волны 300-400 нм и коротковолновый диапазон 220-300 нм.

Для фотометрических измерений в видимой и ближней инфракрас­ной областях применяются кюветы из обычного стекла. Для ближней ульт­рафиолетовой области нужны кюветы из специальных сортов стекла - увио­левые; в коротковолновой ультрафиолетовой области пригодны только кюветы из кварца или сапфира (высокой стоимости).

Последовательность операций при работе на спектрофотометрах или фотометрах различных конструкций несколько различаются, но имеется общий принцип. Сначала устанавливают нужную длину волны, выбирая светофильтр на фотометре или вращая соответствующую рукоятку на спектрофотометре. Следующий этап - выведение нуля. Для этого в кюветодержатель устанавли­вают кювету с контрольным раствором (растворитель или раствор, получен­ный в результате холостого опыта, то есть без проведения химической реак­ции). Изменяя интенсивность светового потока, выводят показания при­бора на величину шкалы, предусмотренную инструкцией (чаще всего - на нуль). После этого устанавливают опытную или стандартную пробу и по шкале прибора проводят отсчет величины оптической плотности.

В биохимических лабораториях наиболее широко применяются фотоэлектроколориметры КФК, КМФЦ-2, БИАН-120 и др.; спектрофото-метры СФ-16, СФ-26 и их современные модифика­ции.

Аминокислоты

Аминокислоты - это производные карбоновых кислот, у которых один или несколько атомов водорода замещены на аминогруппу.

Известно более 150 аминокислот, из них только 20 входят в состав белков (эти аминокислоты называют белковыми). У белковых аминокислот аминогруппа находится в α-положении (т.е. у 2-го атома углерода). Белковые аминокислоты относятся к L-оптически активному ряду.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: