Сделай Сам Свою Работу на 5

Дифференциальный синтез РНК

Третий постулат – то, что лишь небольшая часть генома участвует в создании тканеспецифических продуктов, – был проверен также для многих организмов. Цитоплазматическая РНК насекомых и позвоночных гибридизовалась менее чем с 10% возможных доступных сайтов ДНК, хотя были получены данные, что эта РНК содержит все тканеспецифические последовательности. При изучении дрозофилы (Becker, 1959) и личинок комара Chironomus (Beermann, 1952) было обнаружено, что в хромосомах существуют «раздутые» участки. Такие участки, или пуфы, обнаруживались в различных областях хромосом из разных тканей, и их расположение менялось в ходе развития клеток (рис. 10.26). Кроме того, образование некоторых пуфов можно было индуцировать или подавить изменени-


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ__________________ 101

Рис. 10.26. Последовательность пуфов на участке хромосомы III в слюнной железе личинки Drosophila melanogaster. А. Б. Личинка в возрасте 110 ч. В. Личинка в возрасте 115 ч. Г. Д. Стадии предкуколки. разделенные 4 ч. Обратите внимание на пуфинг и регрессию дисков 74EF и 75В. Другие диски (71DE, 78D) образуют пуфы позже, однако большинство дисков совсем не образуют пуфы в этот период. (Фотография с любезного разрешения M. Ashburner.)

 

ем физиологических условий, например при тепловой или гормональной обработке (Clever, 1966; Ashburner, 1972; Ashburner, Berendes, 1978).

В настоящее время известно, что эти пуфы представляют собой расплетание политенной хромосомы в менее компактную структуру (рис. 10.27). Впервые данные о том, что такие пуфы являются местом активного синтеза мРНК, были получены Бирманом (Beermann, 1961). Этот автор обнаружил два скрещивающихся между собой вида Chironomus, один из которых продуцировал мажорный белок слюны, а другой не продуцировал (рис. 10.28). У продуцента в определенной зоне политенных хромосом из клеток слюнной железы личинки имелся большой пуф (кольцо Бальбиани); этот пуф отсутствовал у непродуцентов. У гибридной личинки, полученной в результате скрещивания продуцента с непродуцентом, синтезировалось промежуточное количество белка слюны. После скрещивания двух гибридных особей способность продуцировать белок слюны сегрегировала в соответствии с правилом Менделя (1 хороший продуцент:2 промежуточных продуцента: 1 непродуцент). Кроме того, оказалось, что хороший продуцент имеет два пуфа (по одному на каждой гомологичной хромосоме), тогда как промежуточный продуцент имеет лишь один пуф. Исследователь пришел к выводу, что генетическая информация, необходимая для синтеза данного белка слюны, представлена в этом дистальном диске хромосомы и что синтез данного продукта зависит от превращения этого диска в пуф.



Дополнительные данные о том, что хромосомные пуфы синтезируют мРНК, были получены при исследовании пуфов кольца Бальбиани 2 из клеток Chironomus tentans. Исключительно большие размеры кольца Бальбиани 2 (BR2) позволяют изолировать его с помощью методов микрохирургии. Для анализа продуктов его активности используют электрофорез и радиоавтографию (Lambert, Daneholt, 1975). На рис. 10.29 показано выделение BR2 из хромосомы IV Ch. tentans. Чтобы проследить судьбу РНК кольца Бальбиани, из клеток слюнных желез можно выделить также нуклеоплазму и цитоплазму. Транскрипцию в кольце Бальбиани 2 выявляют, инкубируя изолированные слюнные железы с радиоактивными предшественниками РНК и затем экстрагируя радиоактивную РНК из участка BR2 рассеченной хромосомы (Lambert, 1972). Коэффи-


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

102_______________ ГЛАВА 10_____________________________________________________________________________

 

Рис. 10.27. Проксимальный конец хромосомы IV из слюнной железы Chironomus pallidivitatus,содержащий гигантский пуф BR2 А. Микрофотография в фазовом контрасте окрашенного препарата, на которой виден гигантский пуф на политенной хромосоме Б. Схематическое изображение участка BR2, претерпевающего пуфинг (А – по Grossbach, 1973; фотография с любезного разрешения V. Grossbach, Б – по Beermann, 1963.)

 

Рис. 10.28. Корреляция пуфинга со специализированными функциями клеток слюнной железы Chironomus pallidivitatus. А. Хромосома IV из клетки слюнной железы, продуцирующей зернистый секрет,имеет дополнительное кольцо Бальбиани [ ВR 4(SZ)] Б. В хромосоме IV из прозрачной слюнной клетки обнаруживаются только кольца Бальбиани 1, 2 и 3 (BR1, BR2, BR3). В. Генетические данные, свидетельствующие о том, что синтез основного белка слюны зависит от формирования пуфа BR4(SZ). У личинок, синтезирующих большие количества зернистого секрета, обе хромосомы IV в клетке слюнных желез имеют пуфы BR4(SZ), тогда как у личинок, не синтезирующих этот секрет, в хромосомах не имеется таких пуфов. Промежуточные продуценты имеют лишь одну хромосому IV с пуфом BR4(SZ) в каждой слюнной железесинтезирующей этот секрет (Б. по Beermann, 1961; фотографии с любезного разрешения W. Beermann.)

 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ_______________ 103

Рис. 10.29.Выделение участка BR2 Chironomus tentans с помощьюмикроманипуляций. Интактная хромосома IV может быть разделена на три фрагмента, один из которых содержит BR2. (Из Lambert, Daneholt, 1975; фотография с любезного разрешения В. Lambert.) Рис. 10.30. Транскрипция на участке BR2 хромосомы IV из клеток слюнной железы Chinmamus tentons. А. Препарат хромосомы, окрашенный толуидиновым синим. Стрелками указаны точки, в которых хромосома была разрезана дляпоследующего синтеза РНК in vitro. Б. Радиоавтограф после гибридизации in situ BR2-PHK с препаратом хромосом. (Из Lambert, 1972; фотографии с любезного разрешения В. Lambert.)
Рис. 10.31. Электронная микрофотография быстроседиментирующих полисом из участка BR2 хромосомы IV С. tentans. Полисомы синтезируют гигантский секреторный белок, специфичный для слюнных желез. (Из Daneholt et al., 1976; фотографии с любезного разрешения В. Dancholt.)

циент седиментации этой РНК составляет 75 S, что указывает на исключительно большие размеры РНК (примерно 50 000 оснований). Эта 75S-PHK гибридизовалась исключительно с областью BR2 на хромосоме: следовательно, ее активная транскрипция проходила на ДНК пуфа, а не в каком-либо ином локусе (рис. 10.30). В отличие от большинства других РНК размеры 75S-PHK из кольца Бальбиани заметно не уменьшались при ее перемещении через ядро в цитоплазму. Отмеченное свойство делает эту РНК особенно ценной, поскольку если она кодирует белок, то из-за большого количества связывающихся с ней рибосом должен образовываться комплекс с исключительно высокой молекулярной массой. Поэтому слюнные железы вновь инкубировали с радиоактивными предшественниками РНК и комплексы цитоплазматических полисом осаждали в градиенте сахарозы. Некоторые полисомы характеризовались очень высоким коэффициентом седиментации. Этот результат указывает на присутствие РНК, способной связать большое количество рибосом, что и наблюдалось в действительности (рис. 10.31). Из этих гигантских полисом экстрагировали РНК (удаляя рибосомы с помощью ЭДТА) и в итоге получали 75S-PHK, которая гибридизовалась исключительно с областью BR2 хромосомы (Wieslander, Daneholt, 1977). Таким образом. РНК, транскрибируемая в области, где образуется пуф в слюнной железе личинки, затем участвует в синтезе белков на цитоплазматических рибосомах. Следовательно, пуфы на хромосомах слюнных желез активно синтезируют мРНК.

Боннер и Пардью (Bonner, Pardue, 1977) на молекулярном уровне получили данные, свидетельствующие о том, что по крайней мере некоторые пуфы отражают регулируемую в развитии транскрипцию отдельных генов. Учитывая классическое наблюдение, что экдистерон вызывает появление одних пуфов и исчезновение других (рис. 10.32,.·А), эти исследователи инкубировали слюнные железы дрозофилы в среде с радиоактивными предшественниками РНК. Некоторые культуры содержали экдистерон, а другие – не содержали. Из этих культур выделяли РНК, которую затем связывали с хромо-


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

104____________ ГЛАВА 10_____________________________________________________________________________

Рис. 10.32. Пуфы, индуцированные экдистероном. в культивируемых клетках слюнной железы D. melanogaster. Показан тот же участок хромосомы, что и на рис. 10.26. А. Цикл пуфинга. индуцированный экдистероном. I – неинкубированный контроль; // – V – хромосомы, стимулированные экдистероном соответственно через 25 мин. 1, 2 и 4 ч.· Б. Гибридизация радиоактивной РНК in situ показывает, что хромосомы из культивируемых клеток слюнной железы после стимулирования экдистероном транскрибируют РНК в специфических участках (74EF и 75В). (А – с любезного разрешения М. Ashburner; Б – по Bonner, Pardue, 1977.)

сомами слюнных желез с помощью гибридизации in situ. Гибридизация РНК с пуфами, индуцированными экдистероном, наблюдалась только в случае, если РНК была мечена в присутствии экдистерона (рис. 10.32. Б). Гибридизация с пуфами, подавляемыми экдистероном, проходила наилучшим образом, когда использовали РНК из тех желез, которые культивировали без экдистерона. Кроме того, РНК из имагинальных дисков, стимулированных экдистероном. не гибридизовалась со стимулированными экдистероном пуфами слюнных желез. Благодаря этому выяснилось, что эти пуфы являются тканеспецифичными, они меняются при изменении клеточной активности и в них синтезируются тканеспецифичные РНК.

Дифференциальная активность генов регулируется во времени и в пространстве. Для определения времени транскрипции определенных генов весьма ценными оказались клонированные гены. Сарджент и Дэвид (Sargent, Dawid, 1983) из зародышей Xenopus на стадии гаструлы выделили мРНК, которая отсутствовала в яйце. К этой мРНК были получены кДНК-копии. Эти кДНК из клеток гаструлы исследователи смешивали с избытком мРНК из ооцитов. Если мРНК ооцита гибридизуется с комплементарной ДНК гаструлы, то это означает, что данная кДНК получена для фракции мРНК, которая присутствует как в ооците, так и в зародыше на стадии гаструлы. Полученные двухцепочечные гибридные молекулы удаляли с помощью фильтрации, оставляя, таким образом, популяцию молекул кДНК, специфичных для гаструлы. Затем эти кДНК делали двухцепочечными (с помощью ДНК-полимеразы) и вводили в векторы для клонирования. Этот метод называют клонированием с вычитанием. Он позволяет получить стадиоспецифичную библиотеку клонов, мРНК для которых обнаруживается на одних стадиях и отсутствует на других (рис. 10.33).

Затем исследователи брали зародышей на разных стадиях развития от зиготы до головастика и для каждой стадии изолировали РНК. Эту РНК наносили в точки на нитроцеллюлозные фильтры так, чтобы на каждом фильтре была РНК со всех стадий. После того как РНК запекли на фильтре, одноцепочечную ДНК, полученную из отдельных клонов, метили радиоактивностью и инкубировали с фильтрами. В случае если ген транскрибируется на данной стадии, радиоактивная кДНК для этого гена


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

___________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ__________________ 105

 

Рис. 10.33. Клонирование с вычитанием генов Xenopus laevis, репрессирующихся специфично на стадии гаструлы. К мРНК, выделенной на стадии гаструлы, была получена кДНК. которая затем была гибридизована с мРНК ооцита. Те фракции, для которых последовательности кДНК гаструлы не нашли комплементарные последовательности в мРНК ооцита, представляют собой продукты генов, активных на стадии гаструлы, но не в ооците. Эти гены были клонированы с помощью приготовления двухцепочечных кДНК и добавления линкеров, необходимых для встраивания в клонирующие векторы.

 

должна найти на фильтре свой комплемент среди мРНК данной стадии. Затем несвязавшуюся кДНК отмывали, а связавшуюся радиоактивную кДНК регистрировали с помощью радиоавтографии. Этот метод называют дот-блоттингом. На рис. 10.34 показаны временные зависимости экспрессии для 17 генов, которые функционируют на разных этапах гаструляции. Ни один из них не экспрессируется ранее средней бластулы на седьмом часу развития. Некоторые гены (DG64, DG39) экспрессируются сразу после этого, тогда как другие гены (например, DG72 или DG81) начинают транскрибироваться на стадии средней гаструлы примерно семью часами позже. После активации уровень активности некоторых генов (DG76, DG81) сохраняется, тогда как у других (DG56 или DG21) он существенно изменяется.

Если с помощью дот-блоттинга можно выявить временную специфичность экспрессии генов, то пространственную специфичность, т.е. тканеспецифический характер экспрессии генов, можно продемонстрировать с помощью модифицированного метода


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

106_______________ ГЛАВА 10_____________________________________________________________________________

 

Рис. 10.34. «Дот-блот»-гибридизация, демонстрирующая периоды транскрипционной активности 17 генов в развитии Xenopus. Накопление специфичных мРНК в цитоплазмеопределяли с помощью запекания всей мРНК с последовательных стадий эмбриогенеза и инкубации приготовленной бумажной полоски с радиоактивной ДНК, полученной из кДНК-клона, специфичного для гаструлы. При совмещении этих полосок получается картина динамики активности специфичных генов в развитии. (Из Jamrich et al., 1985; фотография с любезного разрешения I. Dawid, M. Sargent.)

 

Рис. 10.35. Визуализация мРНК, специфичной для эктодермы, у морского ежа S. purpuratus с помощью гибридизации in situ. На верхнихфотографиях представлены срезы личинок на стадии средней гаструлы (А) и плутеуса (Б) при фазово-контрастной микроскопии. В нижнем ряду показаныте же срезы, гибридизованные с радиоактивной кДНК к мРНК, специфичной для эктодермы, при негативном контрасте. Гибридизацияс РНК (выявляется как белые точки) происходит только в тех клетках, которые вошли или войдут в состав дорсальной эктодермы. (Из Lynn et al., 1983; фотографии с любезного разрешения R. Angerer, L. Angerer.)

 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ________________ 107


гибридизации in situ. Этот метод был использован для демонстрации тканеспецифичности экспрессии определенных генов у зародышей морского ежа (Lynn et al., 1983). ДНК морских ежей разрушали с помощью рестриктазы, и ее фрагменты встраивали в плазмиды. Было обнаружено, что некоторые из этих клонов содержат ДНК, которая гибридизуется исключительно с мРНК, изолированной из эктодермы зародыша морского ежа. Затем эти специфичные для эктодермы плазмиды метили радиоактивностью с помощью ник-трансляции. Полученную радиоактивную ДНК денатурировали до отдельных цепей и гибридизовали со срезами зародышей морских ежей. На рис. 10.35 показано, что радиоактивная ДНК этих плазмид узнает РНК только в тех клетках гаструлы, которые дают начало дорсальной эктодерме плутеуса. Эта ДНК узнает также дорсальную эктодерму самой личинки. Известно, что соответствующие РНК синтезируют набор кислых белков, характерных для эктодермы. Таким образом, мы можем использовать гибридизацию in situ для визуализации пространственного распределения дифференциального синтеза РНК.

РЕЗЮМЕ

На основе данных, представленных в этой главе, мы можем сделать следующие выводы:

1. В дифференцированных клетках большинства типов неиспользуемые гены сохраняются в форме, которая допускает их экспрессию при соответствующих условиях.

2. В особых случаях, таких, как образование плазматических клеток, клеточная дифференцировка сопровождается утратой генетического материала. (Даже в этих примерах утрата специфических последовательностей ДНК является следствием, а не причиной дифференцировки.)

3.Существуют виды мРНК. синтез которых регулируется в ходе развития. Можно сказать, что эта мРНК продуцируется только определенными клетками на определенных стадиях развития (это не означает, что все виды мРНК регулируются подобным образом или что все развитие определяется дифференциальной транскрипцией генов).

В итоге мы получаем парадигму дифференциальной экспрессии генов: дифференцированные клетки содержат одни и те же гены, но экспрессия этих генов регулируется таким образом, что разные клетки синтезируют разные белки. В оставшихся главах этой части будут рассмотрены механизмы, с помощью которых дифференциальная экспрессия генов осуществляется во времени и пространстве.

ЛИТЕРАТУРА




 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

108_______________ ГЛАВА 10_____________________________________________________________________________


 

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.



©2015- 2019 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.