Миогенез: дифференцировка скелетной мышцы

Скелетная мышца образована пучками поперечнополосатых мышечных волокон — симпластов. развивающихся из многоядерных мышечных трубочек. В середине шестидесятых годов специалисты в области биологии развития дискутировали по поводу происхождения мышечных трубочек: возникают ли они в результате слияния нескольких одноядерных клеток-предшественников мышцы (миобластов) или образуются путем многократных делений ядра единичного миобласта, не сопровождающихся цитокинезом. Данные, полученные из двух независимых источников, показали, что мышечные трубочки формируются путем слияния миобластов.

Наиболее значительных успехов в изучении развития мышц удалось достичь после того, как было показано (Königsberg. 1963). что миобласты могут дифференцироваться в мышечные трубочки в условиях культивирования in vitro. Культивирование in vitro позволило исследователям изучить механизм этого процесса и связать его с дифференцировкой мышечного волокна. Клетки из эмбриональных областей, содержащих миобласты, отделяли одну от другой с помощью переваривания внеклеточного матрикса трипсином. Затем их помещали в покрытые коллагеном чашки Петри, содержащие питательные вещества и сыворотку (рис. 6.6). Через 48 ч подавляющее большинство клеток представляло собой быстро делящиеся миобласты. Вскоре после этого в миобластах прекращался синтез ДНК и они сливались с соседними клетками, образуя широкие мышечные трубочки (Königsberg, 1963), которые начинали синтезировать специфические для мышц белки. В многоядерных мышечных трубочках деления ядер и синтеза ДНК не наблюдается.

Слияние миобластов, приводящее к образованию мышечных трубочек, четко разделяется на два отдельных процесса. На первой стадии наблюдаются миграция клеток, узнавание и выстраивание их в ряд. В культуре изолированных клеток грудной мышцы 11-дневного куриного зародыша (которая еще содержала большое число одноядерных миобластов) можно было наблюдать, что эти клетки делились и мигрировали. Многие из мигрировавших клеток затем сливались и образовывали мышечные трубочки. Оказалось возможным (Nameroff, Munar, 1976) от-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

_______________ РАННЕЕ РАЗВИТИЕ ПОЗВОНОЧНЫХ. МЕЗОДЕРМА И ЭНТОДЕРМА____________ ___________ 191

Д

Рис. 6.6. Дифференцировка миобластов у зародышей перепела. Миобласты помешали в культуральную среду, затем фиксировали, окрашивали и фотографировали на сроках 2, 3 и 5 сут после начала культивирования. А. Двухдневная культура, состоящая из одноклеточных миобластов. Б. Слияние миобластов, обнаруживаемое впервые в трехдневной культуре. В. Увеличение числа ядер в многоядерных мышечных трубочках в пятидневной культуре. Г. Та же 5-дневная культура при малом увеличении: наблюдается интенсивное слияние клеток. Д. Многоядерная мышечная трубочка при большем увеличении: видна характерная поперечная исчерченность. Масштабная полоска соответствует 0.01 мм (на рис. ошибка). (Из Buckley, Konigsberg, 1974; фотографии с любезного разрешения J.M. Konigsberg.)

делить процесс узнавания (выстраивание миобластов в цепочку) от процесса слияния, обработав культивируемые клетки фосфолипазой С. Этот фермент препятствует слиянию мембран, но не действует на процесс узнавания. Поэтому в присутствии фермента клетки образовывали цепочки, но их мембраны не сливались. Эти опыты также показали, что процесс узнавания ответствен за остановку синтеза ДНК в миобласте. ³Н-тимидин включался в ДНК мигрирующих миобластов, но не включался в миобласты, расположенные в цепочку (рис. 6.7). Следовательно, процесс узнавания клетками приостанавливает их дальнейшее деление.

Вторая стадия миогенеза это процесс слияния миобластов. Оба события — и узнавание, и слияние — зависят от наличия ионов кальция, но во время слияния ионы кальция должны поступать в миобласты. В соответствии с этим слияние можно активировать

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

192_______________ ГЛАВА 6_______________________________________________________________________________

Рис. 6.7. Синтез ДНК в культуре миобластов куриного зародыша. Миобласты были обработаны фосфолипазой С, а затем подвергнуты воздействию 3H-тимидина. Не прикрепившиеся миобласты продолжают делиться и поэтому включают 3Н-тимидин в ДНК. Включенные в ДНК меченые нуклеотиды вызывают потемнение зерен серебра в эмульсии, что можно обнаружить после проявления пленки. Выстроившиеся в одну линию (но еще не слившиеся) клетки (показаны стрелками) метку не включают. (Из NumerolT, Munar, 1976; фотографии с любезного разрешения М. Nameroff.)

ионофорами кальция, такими, как A23I87, который переносит ионы кальция через клеточные мембраны (Schainberg et al., 1969; David et al., 1981). Если выстраивание миобластов в цепочку опосредовано гликопротеидами клеточной мембраны (Knudsen, 1985), то их слияние, по-видимому, регулируется интенсивной реорганизацией мембранных компонентов, приводящей к образованию участков, свободных от белков и содержащих фосфолипиды (Kaufman, Foster, 1985; Wakelam, 1985). Было показано (Kalderon, Gilula, 1979), что опосредованное кальцием слияние миобластов происходит в тех участках их мембран, которые обогащены фосфолипидами. Эта гипотеза объясняет, почему фосфолипаза С является таким мощным ингибитором слияния клеток.

Хотя узнавание клетками друг друга и их слияние — существенные черты миогенеза. видовая специфичность в этих явлениях отсутствует. Миобласты сливаются только с миобластами, и они не обязательно должны принадлежать одному и тому же виду животных. Показано (Yaffe, Feldman, 1965), что миобласты зародышей крысы и курицы легко сливаются, образуя гибридные мышечные трубочки.

Результаты исследований, проведенных на аллофенных мышах, также свидетельствуют в пользу гипотезы о слиянии миобластов. Таких мышей получают путем слияния двух ранних зародышей; у развивающихся мышей имеются две четко различимые популяции клеток (см. рис. 3.29). В одном из опытов (Mintz, Baker, 1967) объединяли зародышей двух линий мышей, у которых синтезируются разные формы фермента изоцитратдегидрогеназы. Этот фермент, обнаруженный во всех клетках, состоит из двух идентичных субъединиц. Если мышечные трубочки образуются из одной клетки, ядра которой делятся без цитокинеза, то следует ожидать появления у аллофенной мыши двух разных («родительских») форм фермента (рис. 6.8). Вместе с тем, если мышечные трубочки формируются путем слияния миобластов, то следует ожидать появления мышечных клеток, в которых экспрессируются гены не только одной из двух «родительских» изоформ фермента (АА или ВВ), но также и третьей изоформы, образованной субъединицами каждого из родительских типов фермента (AB). Различные формы изоцитратдегидрогеназы могут быть разделены и идентифицированы по их подвижности в электрическом поле. Результаты опыта ясно показали наличие гибридного фермента в экстрактах из скелетных мышц, хотя в экстрактах из всех других тканей был обнаружен фермент только двух родительских типов. Следовательно, мышечные трубочки действительно формируются путем слияния многочисленных миобластов.

Все исследователи считают слияние миобластов и синтез специфических мышечных белков независимыми друг от друга явлениями, хотя и происходящими обычно одновременно. Как только миобласты выстраиваются в цепочку и прекращают делиться. они начинают синтезировать тропомиозин, тяжелую цепь миозина и специфичные для мышц изоформы актина и креатинкиназы. Креатинкиназа представляет собой димерный белок. До слияния миобластов в них синтезируется креатинкиназа, состоящая только из субъединиц В (димер ВВ). К моменту слияния в культуре они начинают синтезировать другую специфичную для мыши форму фермента (М), создавая димеры ММ (рис. 6.9. А). Слияние миобластов можно стимулировать, заменив среду, поддерживающую пролиферацию, средой, в которой отсутствуют определенные факторы роста. В лимитированной среде миобласты прекращают делиться и в течение короткого периода времени сливаются. Эта методика была использована (Devlin, Emerson, 1978) для синхронизации слияния клеток и изучения синтеза миозина, актина и тропомиозина (рис. 6.9, Б). В начале культивирования ни одного из белков обнаружить не удается. Однако ко времени слияния миобластов эти структурные белки очень быстро выяв-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

Рис. 6.8. Схема, иллюстрирующая два возможных механизма формирования скелетных мышц и способ выбора между ними. Аллофенных мышей получают путем слияния мышиных зародышей разных линий: клетки каждой из двух линий можно различить по наличию разных форм фермента изоцитратдегидрогеназы. Этот фермент состоит из двух субъединиц; одна линия мышей продуцирует А-субъединицы изоцитратдегидрогеназы, другая — В-субъединицы. А. Если ферменты синтезируются одной клеткой или в многоядерных клетках, образовавшихся путем деления ядер в одной клетке, то изоформы фермента будут либо АА, либо ВВ, Б. Если в одной и той же клетке имеются два разных ядра, то одно из них может кодировать субъединицу В, тогда как другое — субъединицу А, и в результате некоторые молекулы фермента будут гибридными (AB). Эти три типа молекул разделяют методом электрофореза. Присутствие молекулы AB только в клетках скелетных мышц (но не в других типах клеток) подтверждает правильность модели слияния. (По Mintz, Baker, 1967.)

Рис. 6.9. Синтез новых ферментов, сопутствующий слиянию миобластов. А. Уменьшение активности субъединиц немышечной креатинкиназы (B-типа), сопровождающееся замещением их субъединицами специфичной для мышц креатинкиназы (М-типа) по мере слияния миобластов куриного зародыша, культивируемых in vitro. Слияние начинается после первых суток культивирования, и на вторые сутки культивирования в мышечных трубочках обнаруживается 38% ядер. Б. Синтез специфичных для мышц сократительных белков после перенесения делящихся миобластов в среду, способствующую их слиянию. Культуры метили 35S-метионином, который включается в белки, а затем через определенные сроки выявляли синтез разных белков (А — по Lough, Bischoff, 1977; Б —поDevlin, Emerson, 1978.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

194_______________ ГЛАВА 6_______________________________________________________________________________

ляются. Показано (Sutherland, Königsberg, 1983), что, когда прекращается синтез ДНК, синтез специфичных для мышц белков увеличивается как обычно, даже в том случае, если слияние миобластов подавлено понижением концентрации кальция в среде. Отсюда можно заключить, что, как только клетки прекращают делиться, они приобретают способность и к слиянию, и к синтезу специфичных мышечных белков.

Общепризнано, что огромное увеличение синтеза таких белков происходит к моменту слияния миобластов, однако остается неясным, на каком уровне осуществляется контроль этих процессов — на транскрипционном, трансляционном или на том и другом вместе. Некоторые исследователи (см. гл. 14) сообщили, что в миобластах до их слияния обнаруживаются мРНК, специфичные для мышечных белков. Если это так, то акт слияния должен действовать как сигнал для начала трансляции этих уже имеющихся мРНК. Другие исследователи (Devlin, Emerson, 1979; Daubas et al., 1981 ) не смогли обнаружить в делящихся миобластах мРНК для сократительных белков. Эти исследователи полагают, что синтез таких белков происходит на новообразованных мРНК. В любом случае слияние миобластов и накопление специфичных мышечных белков, по-видимому, координируется прекращением синтеза ДНК в пролиферирующих миобластах.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: