Сделай Сам Свою Работу на 5

Бактериофаги, технология их приготовления.

Бактериофаги представляют собой вирусы, поражающие бактерии и вызывающие их разрушение -- лизис. Открытие явления лизиса у возбудителя сибирской язвы впервые зафиксировал отечественный ученый Н. Ф. Гамалея еще в 1898 году. Однако причины такого лизиса оставались невыясненными. В 1915 году Творт выделил особый фильтрующийся агент, который вызывал лизис колоний стафилококка. В 1917 году д,Эррель такой агент выделил из испражнений больного тяжелой формой бактериальной дизентерией. Этот агент вызывал растворение культур возбудителя дизентерии. Фильтрация растворенной культуры и новые добавления фильтратов к свежим культурам приводили к их лизису. Такой переносимый из культуры в культуру литический агент д,Эррелем был назван бактериофагом. В последующем, в сороковые годы, с помощью электронного микроскопа удалось подтвердить, что бактериофаг является вирусом. В настоящее время фаги выявлены почти у всех патогенных и многих непатогенных прокариотных микроорганизмов, у энтеробактерий, микобактерий, коринебактерий, стрептококков, стафилококков, сардин, споровых и актиномицетов. Бактериофаги широко распространены в природе. Практически они обнаруживаются во всех объектах среды, где обитают микроорганизмы.

Бактериофаги, выделенные из патогенных микроорганизмов, мо гут быть использованы как специфические лечебно-профилактические биопрепараты.

Давно установлено, что в популяции одного микроорганизма могут появиться клетки, устойчивые к фагам, и из них вырастают вторичные фагоустойчивые микроорганизмы. Изучая свойства вторичных фагорезистентных культур Salmonella ovis, И. К. Тутов (1961) установил, что они не изменяют антигенных свойств, но теряют свою вирулентность. На основании этих исследований была доказана возможность использования вторичных фагорезистентных культур с целью изготовления живых вакцин.

Используя визуальный феномен лизиса культур микроорганизмов, специфическим бактериофагом, в необходимых случаях его используют как диагностический тест. Например, в бактериологических лабораториях феномен бактериофагии используется как высокоспецифическая реакция при диагностике сибирской язвы.



Для этой цели биопредприятиями выпускается два сибиреязвенных бактериофага: КВИЭВ и Гамма МВА. Для их изготовления используют авирулентные штаммы возбудителя сибирской язвы. Такие культуры выращивают в МПБ или дрожжевом, бульоне. Непременным условием является то, что при засеве нужно использовать молодые, 5--6 часовые расплодки производственных штаммов возбудителя. Кроме того, сразу после посева штаммов В. antrhacis в бутыли вносится бактериофаг. Содержимое бутылей перемешивается. И они ставятся в термостат на 10--18'часов. По истечении указанного срока среду фильтруют через стерилизующие пластины или патроны. В фильтрате остается только бактериофаг. После изготовления бактериофага его разливают в ампулы и подвергают контролю на стерильность, активность и специфичность.

Сибиреязвенный бактериофаг используется как диагностикум при дифференциации - возбудителя сибирской язвы от антракоидов.

Примерно по такой же методике готовятся бактериофаги и к другим микроорганизмам. Но выращивание их, например сальмофагов, колифагов, проводится в точение 6--10 часов при 37° С и выдерживании до 24 часов при комнатной температуре (Николаенко Н. И., 1954; Шустер Б. Ю., Малахов Ю. А., Соловьева В. С, Тугаринов О. А., 1981). [8, 11]

Технология производства и контроль бактериофагов
В производственных условиях для изготовления препарата бактериофага применяются только апробированные штаммы бактериофагов и культуры соответствующих микробов, обладающих типичными морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами. Штаммы бактериофагов должны быть музейными и рабочими. На производстве они часто называются маточными бактериофагами. Музейные производственные штаммы бактериофагов ежегодно обновляются путем выделения новых или пассажами имеющихся штаммов бактериофага через организм больного, а также адаптацией к свежевыделенным, резистентным к данному бактериофагу культурам. Маточный бактериофаг должен размножаться и пассироваться только на соответствующей культуре в жидкой питательной среде, например, брюшнотифозный бактериофаг пассируется на культуре брюшнотифозной палочки в бульоне Мартена.
Рабочий маточный бактериофаг готовится из очередной серии музейного штамма бактериофага, отдельно на каждом из производственных штаммов микробов.
Препарат бактериофага представляет собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом. Он содержит большое количество размножившихся фагов, обладающих специфическими лизирующими свойствами.
Получение бактериофага в настоящее время осуществляется в специальных аппаратах - реакторах, емкостью от 250 до 1000 л, с применением аэрации как фактора, стимулирующего развитие микроорганизмов. Для производства бактериофага берется его рабочая маточная раса и соответствующие культуры микробов. В реактор наливается жидкая питательная среда, например, бульон Мартена или Хоттингера для изготовления брюшнотифозного и дизентерийного бактериофагов с рН 7,4-7,6 и стерилизуется при температуре 110 °С в течение 40 минут. После стерилизации среда охлаждается до 39 °С и засеивается соответствующей микробной культурой и маточным бактериофагом одновременно. Для засева употребляются 18-часовые агаровые культуры, которые прибавляются из расчета 50 млн. микробных тел на 1 мл среды. Бактериофаг добавляется в количестве не более 0,3 % по отношению к объему питательной среды. Среду с засеянными в ней культурой и бактериофагом оставляют при температуре 37 °С на 6-18 часов. Бактериофаги активно размножаются внутри бактериальных клеток, увеличиваясь в количестве и вызывая их лизис, что внешне проявляется полным просветлением среды. К полученному лизату добавляется в качестве консерванта хинозол (0,01 %) или фенол (0,25 %) и не позже чем через 2 часа после этого содержимое реактора фильтруется через бактериальные фильтры (асбестовые пластины, свечи Шамбеолена или свечи ГИКИ соответствующей пористости) для удаления оставшихся микробных клеток.
Полученный препарат-бактериофаг должен иметь вид, совершенно прозрачной жидкости желтого цвета большей или меньшей интенсивности. Он проходит контроль на стерильность, безвредность и литическую активность, т.е. вирулентность.
Стерильность бактериофага проверяют обычным способом.
Безвредность препарата проверяют путем введения животным, например, брюшнотифозный и дизентерийный бактериофаги вводят подкожно трем мышам по 1 мл, либо внутривенно одному кролику 5 мл. Наблюдение за животными ведется в течение 3-4 суток; если препарат безвреден, они должны оставаться бодрыми
и здоровыми.
Литическая активность бактериофага, его вирулентность определяются методом титрования на жидкой и плотной питательной среде.
Определение вирулентности методом Аппельмана проводится по следующей схеме: набирается ряд пробирок, содержащих по 4,5 мл мясо-пептонного бульона; в первую из них добавляется бактериофаг в количестве 0,5 мл, тщательно перемешивается другой пипеткой и в количестве 0,5 мл переносится в следующую пробирку, из второй - 0,5 мл в третью и т.д. В серии пробирок бактериофаг разводится 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. Во все пробирки, включая и контрольную, содержащую только 4,5 мл бульона, вносят по 250 млн микробных тел суточной культуры соответствующих бактерий, затем ставят их на 18-20 часов в термостат, после чего учитывают результат. Степень лизиса отмечается плюсами следующим образом: четыре плюса (++++) - абсолютная прозрачность среды, равная стерильному бульону; три плюса (+++) - почти полная прозрачность, лишь незначительно отличающаяся от стерильного бульона; два плюса (++) -
муть, значительная по сравнению со стерильным бульоном, но незначительная по сравнению с контрольной пробиркой; один плюс (+) -
явная муть, но все же более слабая, чем в контрольной пробирке, минус (-) - муть, как в контрольной пробирке.
Определение вирулентности на плотной питательной среде методом Отто заключается в следующем: на определенные сегменты агаровых пластинок в бактериологических чашках, хорошо подсушенных в термостате и предварительно засеянных сплошным газоном соответствующей культуры, наносится по одной капле исследуемого бактериофага определенного разведения, соответствующего разведению в аппельмановском ряду. Капли подсушиваются и чашки помещаются в термостат на 18-20 часов. Результат учитывается по степени лизиса и обозначается плюсами: четыре плюса (++++) - полный лизис; на месте закапывания бактериофага культура не растет; три плюса (+++) - лизис с наличием единичных колоний культуры; два плюса (++) - лизис в виде сливных участков с островками роста культуры; один плюс (+) - лизис в виде отдельных стерильных пятен на сплошном газоне культуры; минус (-) - сплошной рост культуры, не обнаруживается ни одного стерильного пятна.
За титр бактериофага при определении методом Аппельмана принимают то наибольшее разведение его, которое вызывает полное растворение соответствующих микробов. Бактериофаги выпускают, с определенными титрами, не ниже установленных, по инструкции. Так, титр брюшнотифозного бактериофага со всеми штаммами, входящими в титрование, должен быть не ниже 10-7 для штаммов, находящихся в Vi-форме, и не ниже 10-6 для штаммов, находящихся в 0-форме.
После проведения контролей бактериофаг разливается во флаконы нейтрального стекла (по 25, 50 и 100 мл), которые должны быть укупорены резиновой пробкой соответствующего размера и залиты смолкой.
Условия хранения бактериофага такие же, как и других препаратов.
Срок годности брюшнотифозного, холерного; гангренозного, стафилококкового и стрептококкового бактериофагов - один год, а дизентерийного - два года.
Помимо жидких препаратов бактериофага могут изготавливаться также сухие. Для получения их, действующее начало жидкого фаголизата осаждается сернокислым аммонием. Выпавший осадок отделяется от жидкой части, к сырой массе добавляется в качестве стабилизатора глюконат кальция (9 %), смесь тщательно растирается, замораживается при - 30 °С и высушивается под вакуумом.
Выпускается сухой фаг в виде таблеток, которые содержат стабилизированную субстанцию фаголизата, обычно применяемую таблеточную смесь (глюкозу, глюконат кальция, тальк, стеарин) и покрыты защитной кислотоустойчивой оболочкой из ацетилцеллюлозы. Одна таблетка cyxогo бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого.
В отношении стерильности и безвредности к сухим бактериофагам предъявляются те же требования, что и к жидким. Титр сухих бактериофагов устанавливается в соответствии с их лизирующей активностью, по отношению к разным видам и типам микробов.
Применяются они в тех же случаях, что и жидкие бактериофаги. Срок годности сухих фагов - 1 год.



©2015- 2021 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.