Глава 1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О БИОТЕХНОЛОГИИ

Современные биотехнологические производства — сложный ком­плекс взаимосвязанных биофизических, биохимических и физико-химических процессов; в этих технологических процессах производство и биология представляют единое целое.

БТ - это использование культур клеток, бактерий, животных, расте­ний, метаболизм и биологические возможности которых обеспечивают выработку специфических веществ. В фармацевтической промышлен­ности БТ охватывает разработку вакцин, синтез гормонов, ферментов, интерферонов, антибиотиков, аминокислот, витаминов, алкалоидов, полисахаридов и других биологически активных веществ (БАВ).

В историческом смысле БТ возникла, когда дрожжи были впервые использованы при изготовлении пива, а бактерии - для получения йогурта.

С 1961 г. БТ тесно связана с исследованиями в области промышлен­ного производства коммерческих продуктов при участии живых орга­низмов, биологических систем и процессов. С этого времени БТ встала на прочный фундамент микробиологии, биохимии и промышленной инженерии.

Промышленный биотехнологический процесс, в котором для произ­водства коммерческих продуктов используются микроорганизмы, обычно состоит из трех ключевых этапов:

1. Исходная обработка: обработка сырья для использования в ка­честве источника питательных веществ для микроорганизма-мишени.

2. Ферментация и биотрансформация: рост микроорганизма-мишени в большом (обычно более 100 л) биореакторе (фермен­тация) с последующим образованием нужного метаболита, на­пример антибиотика, аминокислоты или белка (биотрансформа­ция).

3. Конечная обработка: очистка целевого продукта от компонентов культуральной среды или от клеточной массы (рис. 1).

Цель биотехнологических исследований - максимальное повыше­ние эффективности каждого из этих этапов и поиск микроорганизмов, с помощью которых можно получить целевой продукт.

Наиболее трудным для оптимизации был этап биотрансформации. При использовании природных микробных штаммов выход конечного продукта часто оказывался существенно ниже оптимального. Традици­онные схемы генетического усовершенствования бактерий включают скрининг, отбор и тестирование огромного количества колоний. Такие работы высокозатратны, занимают много времени и при этом можно рассчитывать только на усовершенствование уже существующих, пере­даваемых по наследству свойств штамма, а не на расширение его гене­тических возможностей. И все же к концу 70-х таким образом были усовершенствованы производственные процессы получения целого ря­да конечных продуктов.

С развитием технологии рекомбинантных ДНК природа и возмож­ности БТ резко изменились. Стратегия переноса функциональной еди­ницы наследственности (гена) из одного организма в другой была раз­работана американскими учеными Стенли Козном и Гербертом Бойе-ром в 1973 г. Появилась возможность оптимизировать этап биотрансформации - не просто отбирать высокопродуктивные штаммы микро­организмов и эукариотических клеток, а создавать принципиально но­вые, используя их в качестве «биологических фабрик» по производству инсулина, интерферонов, интерлейкинов, гормона роста, вирусных ан­тигенов и множества других белков. Технология рекомбинантных ДНК позволяет получать в больших количествах ценные низкомолекулярные вещества и макромолекулы, которые в естественных условиях синтези­руются в минимальных количествах. Технология рекомбинантных ДНК - это быстродействующий, эффективный, мощный инструмент, обеспе­чивающий создание микроорганизмов с заранее заданными генетиче­скими характеристиками. Этот инструмент может работать не только с микроорганизмами, но с растениями и животными.

На стыке технологии рекомбинантных ДНК и БТ возникла динамичная, высококонкурентоспособная Молекулярная БТ (МБТ). Биотех­нологическая составляющая МБТ - промышленная микробиология и химическая инженерия; молекулярная составляющая - молекулярная биология, молекулярная генетика бактерий, энзимология нуклеиновых кислот.

История развития МБТ (даты, события)

1917 — введен термин БТ;

1943 - произведен в промышленном масштабе пенициллин;

1944-показано, что генетический материал представляет собой ДНК;

1953-установлена структура инсулина, расшифрована структура ДНК;

1961 - учрежден журнал «Вiotechnology and Bioengineering»;

1961-1966 - расшифрован генетический код, оказавшийся универ­сальным для всех организмов;

1953-1976 - расшифрована структура ДНК, ее функции в сохране­нии и передаче организмом наследственной информации, способность ДНК организовываться в гены;

1963-осуществлён синтез биополимеров по установленной струк­туре;

1970 - выделена первая рестрикционная эндонуклеаза;

- осуществлён синтез ДНК;

1972 - синтезирован полноразмерный ген транспортной РНК;

1975 - получены моноклональные антитела;

1976 - разработаны методы определения нуклеотидной последова­тельности ДНК;

1978 - фирма «Genentech» выпустила человеческий инсулин, полу­ченный с помощью Е. соli;

1981 - синтезированы фрагменты нуклеиновых кислот;

1982 - разрешена к применению в Европе первая вакцина для жи-

вотных, полученная по технологии рекомбинантных ДНК;

1983 - гибридные Ti-плазмиды применены для трансформации растений;

1990-официально начаты работы над проектом «геном человека»; 1994-1995 - опубликованы подробные генетические и физические карты хромосом человека;

1996-ежегодный объем продаж первого рекомбинантного белка (эритропоэтина) превысил 1 млрд долларов;

1997 - клонировано млекопитающее из дифференцированной сома­тической клетки;

2003 - расшифрован геном (набор генов, присущий организму) че­ловека, содержащий приблизительно 30 тысяч генов и три миллиарда «букв» молекул ДНК.

В последние годы родилась новая отрасль генетики - геномика, изучающая не отдельные гены а целые геномы. Достижения молекулярной биологии и генной инженерии дали человеку возможность читатьгенетические тексты вначале вирусов, бактерий, дрожжевых грибков, многоклеточных животных. Например, знание геномной структуры патогенных бактерий очень важно при создании рационально сконст­руированных вакцин, для диагностики и других медицинских целей.Апрель 2003 года ознаменовался сенсацией в биологии и медицине: Международный консорциум по составлению генетической карты че­ловека (Центр геномного секвенирования: Вашингтонский университет я Сенгеровский центр в Кембридже) опубликовал заявление, что уда­лось полностью расшифровать геном человека. Титанический труд сотенисследователей из США, Великобритании, Германии, Франции, Японии и Китая занял более 10 лет и обошелся почти в 3 млрд долла­ров. При этом были разработаны высокоэффективные технологии и ин­струменты картирования, такие как коллекции клеток, в которых есть небольшие фрагменты каждой из хромосом или искусственные дрож­жевые хромосомы, содержащие крупные фрагменты хромосом челове­ка, бактериальные и фаговые векторы, позволяющие размножить (кло­нировать) фрагменты ДНК человека. Быстро прогрессировала техника секвенирования (например, многоканальный капиллярный электрофо­рез ускорил и удешевил расшифровку первичной структуры ДНК). Соз­даны компьютерные программы, позволяющие находить гены в рас­шифрованных участках ДНК.

Ранее было объявлено о «черновой» расшифровке генома человека с точностью 99,9%, сейчас эта точность увеличена на порядок. Осталось заполнить, расшифровать в геноме примерно 400 «дырок». В геноме человека прочитано 3 млрд символов, но решающее значение принад­лежит пониманию смысла прочитанного. Из 30 тыс. генов, составляю­щих геном человека, науке известно о предназначении лишь трети их числа. Полная расшифровка генома человека позволит справиться с множеством недугов, таких как наследственные болезни, рак, заболева­ния сердечно-сосудистой системы, психические и многие другие.

В России существует своя программа «Геном человека», не зависи­мая от Международного консорциума, гораздо более скромная по фи­нансовым возможностям. Ученые на уровне генома изучают связь раз­личных генов с наиболее распространенными заболеваниями, ДНК-диагностику, диагностику хромосомных нарушений, молекулярный ци-тогенетический анализ. Геномная медицина «корректирует» традици­онные методы лечения заболеваний с учетом индивидуальных генети­ческих данных каждого человека. Генетическую обусловленность на­следственных заболеваний определяют около 3 тыс. генов.

Геномные методы идентификации личности, разработанные и прак­тические реализованные в геномике человека, имеют большое значение для общества. Криминалистика получила в свое распоряжение абсо­лютно достоверный метод доказательства: для геномной дактилоскопии достаточно лишь одной капли крови, одного волоса, кусочка ногтя, сле­дов пота, спермы, слюны, перхоти.

Молекулярная биотехнология (МБТ) пользуется достижениями раз­ных областей науки и применяет их для создания разнообразных ком­мерческих продуктов (рис. 2).

Знания и методы биохимии, микробиологии, молекулярной биоло-. гии, генетики, химической технологии, электроники позволяют исполь­зовать потенциал живых клеток в интересах человека. Знания и умения биотехнолога простираются от биохимии и кинетики физиологических процессов в биосистемах (микроорганизм, клетка, вирус) до математи­ческого моделирования, экономики, вопросов управления биотехноло­гическими процессами, объединёнными в сложные системы.

Биотехнология получила возможность воспроизводить нужные про- дукты в неограниченных количествах, используя новые технологии, позволяющие переносить гены в микробные клетки-продуценты или в

организм млекопитающих (трансгенные животные), синтезировать пеп­тиды, создавать искусственные вакцины - это основные биотехнологические процессы, реализующиеся на уровне клетки или с участием от­дельных клеточных структур. В промышленном масштабе подобная БТ

представляет,биоиндустрию.

Гл а в а 2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Характер биологической системы (микроорганизмы, клеточные ли­нии насекомых, растений и млекопитающих, многоклеточные организ­мы) исключительно важен для биотехнологического процесса. Во мно­гих случаях именно генетически модифицированная самовоспроизво­дящаяся биологическая единица (микроорганизм, вирус, растение или животное) является конечным коммерческим продуктом.

Прокариоты и эукариоты. Все живые организмы принято делить на две основные группы: прокариоты и эукариоты. Приблизительно 1,5 млрд лет назад произошел переход от маленьких клеток со сравни­тельно простой внутренней структурой (так называемых прокариот, к которым относятся различные бактерии) к большим по размеру и зна­чительно более сложно устроенным эукариотическим клеткам, подоб­ным клеткам высших животных и растений.

Основные структурные различия про- и эукариот:

• наличие или отсутствие ядра, содержащего хромосомную ДНК;

• строение и химический состав клеточной стенки;

• наличие или отсутствие субклеточных цитоплазматических ор-ганелл.

В прокариотической бактериальной клетке хромосомная ДНК нахо­дится непосредственно в цитоплазме, клетка окружена ригидной кле­точной стенкой. В клетке нет субклеточных цитоплазматических орга-нелл (рис. 3). В оптимальных условиях прокариотическая клетка может делиться каждые 20 мин и таким образом давать жизнь более 10 млрд клеток менее чем за сутки.

В эукариотической клетке (рис. 4) имеется ядро, отделенное от ци­топлазмы ядерной мембраной, хромосомная ДНК находится в ядре. В цитоплазме содержатся различные субклеточные органеляы: мембраны, окружающие ядро, митохондрии, образующие лабиринт эндоплазмати-ческого ретикулума (ЭПР), где синтезируются липиды и мембранные белки. Мембраны формируют стопки уплощенных пузырьков, состав­ляющих аппарат Гольджи, который участвует в синтезе и транспорте различных органических молекул. Мембраны окружают лизосомы (суб-

клеточные структуры диаметром 0,20-0,5 мкм), содержащие гидроли-тические ферменты, необходимые для внутриклеточного пищеварения.

Мембраны, таким образом, защищают от действия этих ферментов бел-ки и нуклеиновые кислоты самой клетки. Мембраны также окружают пероксисомы, содержащие окислительные ферменты, производящие и разрушающие опасные высокореакционоспособные перекиси (пероксиды). Обмен между внутриклеточными, окруженными мембранами струк-\турами и внеклеточной средой происходит с помощью эндоцитоза.

Различают две группы бактерий - эубактерии, населяющие почву, воду и другие организмы, и архебактерии, встречающиеся в таких сре­дах обитания, как болота, океанские глубины, очень соленые воды и горячие кислые источники.

Исходя из температурного режима, который предпочитают те или иные микроорганизмы, их подразделяют на термофилы (от 45 до 90 °С и выше), мезофилы (от 10 до 47 °С) и психрофилы или психротрофы (от -5 до 35 °С). Микроорганизмы, активно размножающиеся лишь в определенном диапазоне температур, - полезный инструмент для реше­ния различных биотехнологических задач. Например, термофилы часто служат источником генов, кодирующих термостабильные ферменты, а генетически видоизмененные психротрофы используются при пони­женной температуре для биодеградации токсичных отходов, содержа­щихся в почве и воде.

Среди множества биологических объектов, использующихся в МБТ, основными «рабочими лошадками» являются бактерии Еscherichia coli, одноклеточные дрожжи Sacharomyces сеrevisiae и различные клеточные линии животного происхождения. Все они играют важную роль в полу­чении белков, кодируемых клонированными генами.

Е. сoli — грамотрицательная непатогенная подвижная палочка дли­ной менее 1 мкм. Традиционная среда ее обитания — кишечник челове­ка, может также высеваться из почвы и воды. Штаммы Е. сoli культиви­руются на обогащенных жидких питательных средах, содержащих ами­нокислоты, витамины, соли, микроэлементы и источник углерода. Е. соН можно культивировать в аэробных и анаэробных условиях, но для оптимальной продукции рекомбинантных белков Е. соli и другие мик­роорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Рост клеточ­ной массы и продукция белка лимитируются содержанием в питатель­ной среде растворенного кислорода, для этого в ферментерах создают условия аэрации.

Кроме Е. соН в МБТ используют множество других микроорганиз­мов, которые подразделяют на две группы:

• микроорганизмы как источники специфических генов (напри­мер, ген, кодирующий стабильную ДНК-полимеразу, которая используется в широкоприменяемой полимеразной цепной ре­акции — ПЦР; этот ген был выделен из термофильных бактерий и клонирован в Е. соН).

• микроорганизмы, созданные генноинженернымми методами для решения определенных задач (например, различные штам­мы Согуnebacterium glutamicumт, генетически модифицирова-ные с целью повышения продукции промышленно важных аминокислот).

Saccharomycesс cereае - непатогенные одноклеточные организмы с диаметром клетки около 5 мкм, во многих отношениях представляют эукариотический аналог Е. сoli. S. сегеvisiае размножаются почковани­ем, их способность к превращению сахара в этанол и углекислый газ издавна использовалась для изготовления напитков и хлеба. Клетки дрожжей делятся каждые 1,5-2 ч. S. сегеvisiае является удобной моде­лью для исследования других эукариот, в т.ч. человека, так как многие гены, ответственные за регуляцию клеточного деления S. ссегеvisiае, сходны с таковыми у человека. Это способствовало идентификации и характеристике генов человека, отвечающих за развитие новообразова­ний. Генетическая система дрожжей является непременным участником всех исследований по изучению ДНК человека.

Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок часто подвергают ферментативной модификации, присоединяя к белко­вой молекуле низкомолекулярные соединения, что необходимо для пра­вильного функционирования белка. Однако Е. соН и другие прокариоты не способны осуществлять эту модификацию, поэтому для получения полноценных эукариотических белков используют S. сегеvisiае и другие виды дрожжей.

В качестве биологических систем в МБТ используют культуру эу­кариотических клеток. Кусочек ткани определенного организма (насе­комого, растения, млекопитающего) обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсином), расщепляющими белки межклеточного мате­риала; при работе с растительными клетками используют ферменты, разрушающие клеточную стенку. Высвободившиеся клетки помещают в питательную среду, содержащую аминокислоты, антибиотики, витами­ны, соли, глюкозу, факторы роста. В этих условиях (деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки) на стенке емкости с культурой образуется клеточный монослой. Если после этого не пере­нести клетки в емкости со свежей питательной средой, рост прекраща­ется. Обычно удается переносить (перевивать, субкультивировать) и поддерживать до 50-100 клеточных генераций исходной (первичной) клеточной культуры, затем клетки начинают терять способность к де­лению и гибнут.

В МБТ устойчивые линии используют для крупномасштабного про­изводства вакцин и рекомбинантных белков, для размножения вирусов и выявления белков, которые кодируются клонированными последова­тельностями ДНК.

Тест-контроль к главам 1-2 Выберите правильные ответы:

1.Определение «Биотехнология - это использование культур кле­ток, бактерий, животных, растений, метаболизм и биологические воз­можности которых обеспечивают получение разнообразных лекарст­венных форм»:

А - верно;

Б — не верно;

В - требует уточнения.

2. Геномика изучает: А - отдельные гены;

Б — совокупность структурных компонентов ДНК;

В - совокупность всех генов организма;

Г - мимические проявления при произношении имени Гена;

Д - механизмы генетических изменений (мутаций).

3. В биотехнологии понятию «биообъект» соответствуют следую­щие определения:

А - организм, на котором испытывают новые БАВ;

Б — организмы, вызывающие микробную контаминацию технологи­ческого оборудования;

В — фермент, используемый для генно-инженерных процессов;

Г - организм, продуцирующий БАВ; Д — фермент, используемый в лечебных целях.

4. Отличительные особенности эукариотической клетки:

А - больший размер;

Б - наличие ядра;

В - ригидная клеточная стенка;

Г — отсутствие субклеточных органелл;

Д - хромосомная ДНК в цитоплазме.

5.Отличительные особенности прокариотической клетки:

А - малый размер;

Б - отсутствие ядра;

В — наличие субклеточных органелл;

Г - многослойная клеточная стенка;

Д - хромосомная ДНК в ядре.

6. Оптимальный температурный режим развития микроорганизмов-мезофилов составляет:

А - 45-90 °С;

Б - 10-47 °С; В - 37 °С;

Г-от-5 до 35 °С;

Д - свыше 90 °С.

7. Типичные направления использования микроорганизмов-психро-филов:

А — источники генов, кодирующих термолабильные ферменты;

Б - источники генов, кодирующих термостабильные ферменты;

В - утилизация токсических отходов;

Г — производство спирта этилового;

Д - производство биогаза.

8. В качестве биологических объектов в биотехнологии используют:

А - Рseudomonas aeruginosa;

Б - Staphylocjccus aureus;

В - Escherichia coli;

Г - С1оstridium tetani;

Д - культуру эукариотических клеток.

9. Способностью превращать (сбраживать) сахар в этанол обладают:

А - Аspergillus oryzae;

Б - Asprgillus terriсо1а;

В — Еscherichia coli;

Г - Ваcillus subtitilis;

Д - Saccharomyces cerevisiае.

10. Отличия Saccharomyces cerevisiае от других прокариотических продуцентов:

А - непатогенность;

Б - аэробный тип развития;

В - анаэробный тип развития;

Г — способность продуцировать полноценные эукариотические белки;

Д-неспособность продуцировать полноценные эукариотические

белки.

 

Предыдущая12345678910111213141516Следующая

---

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:

©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.