Промышленное производство ферментов, получаемых биотехнологическими методами

Схема производства Ф микробиологического происхождения пред­ставлена на рис. 21.

8.1.1. Культивирование продуцентов ферментов

Интенсивность биосинтеза любого фермента микроорганизмом, его продуктивность обусловлена генетическими свойствами продуцента. Функционирование биосинтетической системы регулируется составом питательной среды и динамикой изменения отдельных ее компонентов во время роста микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов -продуцентов ферментов целесообразно в средах строго детерминиро­ванного состава, обеспечивающих направленный биосинтез нужного Ф.

Синтез многих Ф репрессируется легкоусвояемыми источниками углерода (глюкозой, фруктозой, маннозой и др.); этот эффект носит на­звание катаболитной репрессии (иногда глюкозным эффектом). Катабо-литной репрессии подвержен биосинтез таких Ф, как а-амилаза, целлю-лаза, глюкоамилаза, инвертаза, трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты.

Ферменты, катализирующие превращение азотсодержащих субстра­тов, также регулируются по механизму катаболитной репрессии; их биосинтез репрессируется ионами аммония или быстроусвояемыми аминокислотами. Аминокислоты в анаэробных условиях культивирова­ния инициируют биосинтез соответствующих декарбоксилаз. При на­личии в среде большой концентрации мочевины стимулируется био­синтез уреазы. Введение в среду культивирования аргинина индуцирует биосинтез аргиназы. Источниками органического азота могут служить пептон, триптон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина или любая их смесь.

Наличие в среде культивирования различных биополимеров обу­словливает одновременное накопление комплекса протеаз, амилаз, нук-леаз, липаз.

На рост микроорганизмов и биосинтез Ф существенное влияние оказывают ионы кальция, марганца, цинка и др. Ионы железа и магния активируют и стабилизируют протеолитические ферменты. Присутст­вие ионов железа и меди в среде культивирования существенно для биосинтеза железо- и медьсодержащих Ф, участвующих, как правило, в окислительно-восстановительных реакциях (утилизации и превращения энергии). Отсутствие таких ионов может негативно отразиться на ско­рости многих метаболических процессов и на биосинтезе Ф, катализи­рующих эти процессы.

Продуценты Ф, относящиеся к строгим анаэробам, требуют полно­стью безкислородных условий культивирования и очень богатых, полноценных сред. Процесс культивирования в этом случае можно прово­дить в более простых ферментерах, так как не нужна аэрация и переме­шивание.

Оптимизация питательных сред и условий культивирования для обеспечения направленного биосинтеза продуцентом целевого продукта является важным этапом разработки биотехнологического процесса по­лучения высокоочищенных Ф. Преимущественный биосинтез культу­рой нужного продукта с минимальным содержанием посторонних бел­ков позволяет в дальнейшем существенно упростить выделение и очи­стку Ф.

8.1.2. Переработка культуральной жидкости

Большинство Ф промышленного производства относится к внекле­точным, поэтому они находятся в культуральной жидкости. При выде­лении внутриклеточных Ф (изоферментов) основной задачей является сбор клеток, содержащих Ф.

Глубинная культура представляет собой суспензию, содержащую остатки питательных веществ, продукты метаболизма (в том числе вне­клеточные Ф), взвешенные клетки продуцента. В период культивирова­ния обычно происходит ограниченный лизис микробных клеток и в суспензии появляется неконтролируемое количество внутриклеточных метаболитов. Из этой достаточно сложной и многокомпонентной смеси приходится выделять и очищать один Ф.

Технологический процесс начинают с разделения растворимых и нерастворимых веществ, концентрирования и фракционирования, за­канчивают разнообразными способами хроматографической очистки.

Фильтрация жидкости, содержащей мелкодисперсный клеточный материал, частично разрушенные клетки и внутриклеточные полимеры, сопряжена с определенными трудностями. Фильтруемый раствор вязок, склонен к гелеобразованию, осадок сжимается и закупоривает поры фильтра. Для избежания этого применяют крупнопористые фильтрую­щие материалы - диатомиты, кизельгур, бентонит, фильтроперлит и др.: они задерживают очень мелкие частицы, образуются несжимаемые слои фильтрующего материала и биомассы, которые не изменяют фильт­рующих свойств и не забивают фильтры. На фильтрующем материале может происходить сорбция или денатурация некоторых белков, в ре­зультате значительно снижается выход Ф. Обработка фильтроперлита раствором ЭДТА уменьшает потери на 2-6%.

Сепарацию клеточной массы и сопутствующих конгломератов осу­ществляют с помощью центрифуг (фирмы «Beckman», США, MSE, Англия, «Hitadi», Япония).

Дезинтеграция биомассы. Основное количество Ф обычно находит­ся внутри клеток, где он образует комплексы с другими биополимера­ми. Клеточные структуры могут быть разрушены в результате прямого механического воздействия (баллистическими, УЗ-, экструзионными, ферментативными методами - см. гл. 5.7). После дезинтеграции био­массы продуцента фермента получается вязкая, опалесцирующая сус­пензия, содержащая фрагменты клеточных стенок, субклеточных струк­тур и продукты их деградации, а также самые разнообразные высоко- и низкомолекулярные органические вещества. Ферменты находятся в растворенном состоянии, поэтому на одной из первой стадий обработки клеточного гомогената должны быть удалены нерастворимые частицы. Для этого применяют скоростное центрифугирование. Образуется про­зрачный клеточный экстракт, содержащий только растворенные биопо­лимеры и низкомолекулярные компоненты. Среди нежелательных про­цессов, которые могут происходить в таком растворе - протеолиз соб­ственными клеточными протеазами, что влечет потерю каталитической способности, изменение специфичности или стабильности выделяемого Ф. Этот процесс может протекать несмотря на поддержание низкой температуры, особенно при очистке Ф, так как после удаления сопутст­вующих белков Ф становится единственным субстратом протеазы.

Инактивацию протеаз осуществляют обработкой клеточного экс­тракта специфическими ингибиторами-комплексонами (ЭДТА, о-фенантролин, оксихинолин), солями ртути или серебра. Протеазы из клеточных экстрактов могут быть удалены сорбцией на аффинных сор­бентах. Если протеазы термолабильны, а выделяемый Ф термостабилен, их можно денатурировать нагреванием клеточных экстрактов. Денату­рацию нуклеиновых кислот в процессе очистки Ф обусловливает низкая ионная сила или основность среды. Можно использовать специальные осадители, образующие с нуклеиновыми кислотами нерастворимые комплексы. С этой целью применяют бромистый цетилтриметиламмо-ний, стрептомицинсульфат, протаминосульфат, полиэтиленимин. Пол­нота удаления нуклеиновых кислот зависит от рН и ионной силы рас­твора, концентрации осадителя и белка. Чтобы белки остались в раство­ренном состоянии, повышают ионную силу растворов. По эффективно­сти осаждающего действия на нуклеиновые кислоты в экстрактах Е. coli осадители располагаются в следующем порядке: полилизин > полиэтиленимин > бромистый цетиолтриметиламмоний > стрептомицинсуль-фат > протаминсульфат > магния хлорид.

Другой способ удаления нуклеиновых кислот из клеточных экстрак­тов - их гидролиз под действием нуклеаз; для этого применяют пан­креатические ДНК-азу и РНК-азу.

Значительную часть биополимеров можно удалить термообработ­кой клеточных растворов, если Ф термостабилен. Далее проводят хро-матографическую очистку, в том числе аффинную.

В качестве сорбентов применяют различные гели — фосфатов каль­ция, гидроксида алюминия, реже - древесный уголь или гель гидроок­сида цинка. Сорбцию на гелях проводят в слабокислых растворах (рН 5,0-6,0); важны оптимальные соотношения между количеством геля и белкового раствора. Гель, содержащий сорбированный Ф, отделяют центрифугированием.

Для ультрафильтрации используют мембранные фильтры, селек­тивность и скорость работы которых зависят от давления, гидродина­мических условий, температуры, состава фракционируемой смеси и ее концентрации.

Для фракционирования белковых растворов используют нейтраль­ные соли. Известно, что растворимость белков зависит от величины мо­лекул белка, степени их гидратации и ионной силы солевых растворов. Растворяясь, соль связывает воду и, таким образом, изменяет степень гидратации молекул белка, что приводит к их агрегации и образованию осадка. С этой целью применяют аммония сульфат, который обладает стабилизирующим эффектом по отношению ко многим Ф. Обычно вы­ход Ф при фракционировании аммония сульфатом достигает 100%.

Фракционирование белков растворителями. При смешивании орга­нических растворителей с водой изменяется ее диэлектрическая кон­станта и соответственно степень гидратации молекул, вплоть до замены молекул воды молекулами органического растворителя. Все это ускоря­ет образование нерастворимых агрегатов белковых молекул. Обычно для фракционирования растворов Ф применяют этанол и ацетон. При повышенной температуре (более 4 °С) в водно-органических смесях Ф денатурируют, поэтому работы с органическими растворителями про­водят при низких температурах. Органический растворитель охлаждают до (-30) - (-40 °С) сухим льдом или жидким азотом; температура смеси поддерживается при этом на уровне от -10 до -20 °С. Осадок центри­фугируют, затем растворяют в небольшом объеме буферного раствора,

удаляя следы органических растворителей диализом или ультрафильт­рацией через гель.

Для хроматографического фракционирования применяют ионно-обменную, аффинную хроматографию и гель-фильтрацию. Наиболее эффективная очистка Ф достигается ионно-обменной хроматографией с использованием сорбентов на основе сополимеров метакриловой кисло­ты и различных гидрофобных мономеров. В препаративной энзимоло-гии применяют иониты на основе натуральных или полусинтетических полисахаридных матриц (ионно-обменные целлюлозы). Среди многих производных целлюлозы чаще используют ДЭАЭ-, ТЭАЭ-, КМ- и фос-фоцеллюлозы (первые два - аниониты, последние - катиониты). Пред­почтительна гранулированная целлюлоза, гидродинамические свойства которой позволяют проводить хроматографический процесс с большой скоростью.

После элюирования из колонки функционально активных белков сорбент подлежит регенерации. Для удаления неактивных белков, пиг­ментов и др. сорбированных соединений колонку промывают щелоча­ми, водой, кислотами и вновь водой. Иногда для полного удаления пиг­ментов используют органические растворители или детергенты. Про­цесс регенерации колонки завершается обработкой стандартным бу­ферным раствором.

Фракционирование смесей Ф, имеющих различный размер молекул, проводят гель-фильтрацией на разных типах сефадексов - модифици­рованных производных линейного полисахарида полидекстрана. Для фракционирования крупномолекулярных смесей применяют поперечно-сшитые акриламиды под названием ультрагелей (фирма LKB, Швеция) и агарозу в поперечно-сшитом состоянии (сефарозы CL 2В, 4В и 6В). В поперечно-сшитых агарозах хроматографический процесс можно осу­ществить в широком интервале рН и температуры, использовать буфер­ные растворы, содержащие органические растворители, соли. Анало­гичными свойствами обладают декстраны, поперечно-сшитые акрила-мидом сефакрилы: на них можно фракционировать смеси белков с м.м. от 10⁵ до 10⁷.

Наряду с натуральными и полусинтетическими полисахаридными матрицами для гель-фильтрации используют синтетические поликри-ламидные гели (биогель Р, акрилекс фирм «Bio Rad Laboratories», США и «Reanal», Венгрия). Большое количество аминогрупп в их структуре придает полимеру гидрофобные свойства, хорошую набухаемость в во­де с образованим пористой структуры геля. К синтетическим гелям относят также оксиакрилметакрилатные гели-сфероны (фирма «Lachema»,Чехия).

Для гель-хроматографии, в отличие от других методов хроматогра-фического разделения белков, не требуется обессоливать пробу, кор­ректировать рН, не нужны специальные элюирующие буферы. Смесь белков, продвигаясь по сорбенту, освобождается от солей и распределя­ется в порядке уменьшения м.м. Белки и другие компоненты смеси с сорбентом не взаимодействуют. Из колонки вначале выходят самые крупные молекулы, затем — меньшими м.м. и, наконец, соли.

В большинстве случаев после того, как из сорбента вышли белки и все низкомолекулярные компоненты, колонка пригодна для применения в следующем хроматографическом цикле.

Аффинная хроматография характеризуется высокими выходом и степенью очистки выделяемого белка. Основа этого биоспецифического метода состоит в том, что в многокомпонентной смеси между одним или несколькими белками-ферментами и полимерными сорбентами об­разуется стабильная связь, в результате чего эти белки из раствора пе­реходят на нерастворимый сорбент. Чем меньше белков связывает сор­бент, тем выше его селективность (идеальная селективность - связыва­ние одного Ф). Центром связывания служат субстраты, их аналоги, об­ратимые ингибиторы, коферменты, антитела и другие вещества, назы­ваемые лигандами, присоединенные к матрицам. Лиганды специфиче­ски взаимодействуют с активными центрами выделяемого Ф. В качест­ве лигандов используют синтетические аналоги субстратов или кофер-

ментов.

Матрицей сорбента, к которой присоединен лиганд, может быть

любой полимер, обладающий:

крупнопористой гелевой структурой, позволяющей крупным молекулам Ф проникать внутрь структуры и взаимодействовать с центрами связывания;

гидрофильностью структуры, обеспечивающей взаимодействие с водой и отсутствие неспецифического связывания белков по гидрофобным центрам;

отсутствием в структуре заряженных групп, исключающих об­разование неспецифичных электростатических связей; способностью полимера легко активироваться определенными химическими агентами, позволяющими за счет несложных про­цессов присоединять большое количество лиганда;

достаточной химической, механической, микробиологической стойкостью, обеспечивающей стабильность во время работы сорбентов.

Указанным требованиям наиболее полно отвечают различным обра­зом модифицированные агарозы; недостаток агароз - нестойкость к воздействию микроорганизмов, малая механическая прочность, высокая стоимость.

Строгая специфичность аффинного сорбента к выделяемому Ф зна­чительно улучшает сам хроматографический процесс, состоящий из последовательно сменяющихся этапов сорбции, удаления несорбиро-ванных белков и элюирования сорбированного Ф. Условия сорбции подбираются таким образом, чтобы выделяемый Ф сорбировался наи­более полно, а сопутствующие белки не задерживались. Это зависит от рН, ионной силы, природы буферных растворов, температуры. После отмывки сорбента от несорбированных белков резко изменяется один или нескольких из указанных параметров, в результате разрушается комплекс фермента с сорбентом и Ф высвобождается. Элюирование Ф проводят, добавляя в элюент специфически взаимодействующие с фер­ментом вещества - субстраты, коферменты, растворимые ингибиторы. Как правило, это повышает эффективность очистки, так как специфиче­ские агенты не разрушают неспецифические комплексы между сорбен­том и сопутствующими белками.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: