Работа 7. Применение РТ-ПЦР для обнаружения вируса кустистой карликовости малины и других РНК-содержащих вирусов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была предложена Кэри Мюллисом в 1983 году и очень быстро нашла широкое практическое применение. Важность этого метода была признана присуждением Нобелевской премии К. Мюллису.

Основные теоретические предпосылки этого метода состоят в следующем:

1. Все ДНК-полимеразы (как ДНК-, так и РНК-зависимые) в отличие от РНК-полимераз не могут

начинать синтез новой цепи на «голой» матрице, а способны только достраивать 3’ конец олигонуклеотида комплементарного матрице и заранее закрепленного на ней. То есть, они нуждаются в затравке или праймере. Это свойство позволяет точно установить начальные точки синтеза ДНК при ПЦР.

2. Синтез новых цепей идет строго полярно от 5’- к 3’-концу, а движение фермента по матрице идет при этом в противоположном направлении от 3’- к 5’-концу, поскольку комплементарные цепи ДНК антипараллельны.

3. Для ПЦР требуются два праймера, подобранные к комплементарным цепям матрицы таким образом, чтобы синтез новых цепей с мест их прикрепления шел навстречу друг другу.

Принципиальная схема ПЦР представлена на рисунке. Стрелками обозначены праймеры (затравки). Остриё стрелки соответствует 3’- концу праймера и одновременно указывает направление синтеза новой цепи. Самыми тонкими линиями обозначены исходные цепи анализируемой ДНК, более жирными – цепи ДНК, синтезированные после первого цикла реакции, самыми жирными – цепи, синтезированные во втором цикле. Цепи ДНК синтезированные в третьем цикле обозначены двойной линией.

Каждый цикл состоит из трех шагов:

1. Денатурация (плавление) – разъединение цепей ДНК путем нагревания до высокой температуры (92-98⁰).

2. Отжиг – комплементарное связывание праймера при строго заданной температуре.

3. Элонгация (удлинение цепей) – синтез новых цепей ДНК комплементарных матрице, начиная с праймеров.

На схеме показаны результаты амплификации после 1-го, 2-го и 3-го циклов, а также комплементарное связывание праймеров на стадии отжига второго цикла. После первого цикла синтезируется две новых длинных цепи ДНК, После второго – образуется еще две длинных цепи и две коротких, которые образуются за счет встречного синтеза между двумя праймерами. После третьего цикла – общее количество новых длинных цепей доходит до шести, а коротких цепей до восьми, при этом появляются два первых коротких двуцепочечных фрагмента. В дальнейшем количество длинных цепей растет в арифметической прогрессии – прибавляется две цепи после каждого цикла, а количество коротких – экспоненциально, в том числе и двунитевых коротких фрагментов. После 10 циклов их число превышает тысячу, а после 20 – миллион. В итоге после нескольких десятков циклов обнаруживаются практически только короткие фрагменты, а количество длинных оказывается незначительным.

Если в матрице не содержится участков для комплементарного связывания праймеров – реакция не происходит. Поэтому образование специфического фрагмента является аналитическим подтверждением присутствия в пробе соответствующей матрицы ДНК и применяется для:

1. обнаружения патогенов (вирусов, грибов, бактерий, простейших),

2. обнаружения чужеродных генов (анализ генномодифицированных продуктов и клонов бактерий),

3. установления конкретных аллелей генов и выявления мутаций,

4. паспортизации сортов растений и пород животных

5. диагностики наследственных болезней

6. выявления свойств личности, в частности предрасположенности к болезням

7. идентификации личности, установление отцовства

8. выделения новых генов и последовательностей ДНК

9. молекулярного маркирования хромосом и других приложений.

В данной работе при использовании ПЦР для анализа ВККМ или других РНК-содержащих вирусов, нужно учитвать, что ДНК-полимеразы используемые в реакции ПЦР не могут работать с матрицей РНК, поэтому требуется дополнительная стадия обратной транскрипции — синтеза ДНК на матрице РНК перед проведением ПЦР. Эта операция осуществляется с помощью специального фермента — РНК-зависимой ДНК-полимеразы, называемой также обратной транскриптазой или ревертазой. Фермент нуждается в затравке, поэтому в данной работе сначала смешивают пробу РНК и один из праймеров для ПЦР (обратный), нагревают до 94 и охлаждают, то есть проводят посадку праймера на матрицу РНК (отжиг). Затем в реакционную смесь добавляются все четыре дезоксинуклеотидтрифосфата и ревертаза с соответствующим буферным раствором и проводится обратная транскрипция при 37⁰ в течение 30 — 60 минут. Полученная реакционная смесь используется для ПЦР как раствор матрицы ДНК.

Материалы: фрагменты тканей полевых растений или пробирочные растения; стандартные коммерческие наборы реактивов и ферментов для обратной транскрипции, ПЦР и агарозного электрофореза;

Оборудование:ступка с пестиком; стерильная марля; программируемый термостат и ДНК-амплификатор; микроцентрифуга; прибор для горизонтального электрофореза; трансиллюминатор.

Ход работы

Данная работа расчитана по крайней мере на два занятия, проводимые в разные дни, и состоит из нескольких этапов: выделения РНК, обратной транскрипции, ПЦР и электрофореза продуктов реакции в агарозном геле.

При выделении РНК нужно иметь в виду, что это вещество очень не устойчиво и легко гидролизуется РНКазами и химическими агентами, поэтому все операции нужно проводить на холоде (охлаждение льдом), добавлять вещества, подавляющие активность нуклеаз и проводить выделение достаточно быстро. Кроме того для получения достаточно чистой РНК из тканей малины как правило вводятся добавки антиокислителей и веществ, связывающих фенольные соединения.

Выделение РНК проводится по следующей методике:

1. К 5 - 500 мг растительной ткани добавляется 500 мкл 4М гуанидинизоцианатного буфера рН 8.0, содержащего 0.01 М меркаптоэтанола, и 0,01 г поливинилпирролидона. Растирают ткань в стерильной охлажденной ступке до гомогенности.

2. Переносят гомогенат в пробирку, смешивают с 1 мл фенол-хлороформенной смеси и встряхивают 30 сек.

3. Добавляют 50 мкл 3М ацетата натрия, встряхивают.

4.Оставляют на льду на несколько минут и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 5 мин.

5. Собирают верхний водный слой (не захватывая осадка!) и переносят в новую пробирку, добавляют равный объем фенол-хлороформенной смеси, тщательно встряхивают 30 сек и центрифугируют 2 – 3 мин.

6. Верхний слой опять переносят в чистую пробирку и обработку повторяют 2 – 3 раза, как в пункте 5, пока исчезнет интерфазный слой

7. Из супернатанта РНК осаждают добавлением равного объема изопропанола, выдерживая смесь 20

минут при -20⁰С и центрифугируя при максимальной скорости 5 минут.

8. Осадок РНК промывают 500 мкл 70% этанола, центрифугируют и подсушивают осадок в токе воздуха.

Если выделение проводилось из небольшого количества тканей (до 50 мг), не содержащих большого количества фенольных соединений (молодые листья, зеленые плоды), дополнительную очистку можно не проводить. Хранят осадок РНК под спиртом при -20⁰С или растворяют в минимальном объеме ТЕ-буфера для дальнейшего анализа.

Для обратной транскрипции проводят следующие операции:

1. Смесь раствора РНК (0.5 – 1.0 мкг) и обратного праймера (15 – 20 пмоль) нагревают 5 минут при 70⁰С

2. После охлаждения добавляется 100 единиц обратной транскриптазы, 2 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) или по 2 мкл раствора каждого нуклеотида с концентрацией 0.5 mM; 2.5 мкл Х10 буфера для обратной транскипции.

3. Реакция проводится 0.5 – 1.5 часа при 37⁰.

Для проведения ПЦР приготовить реакционную смесь следующего состава:

1. дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), концентрация 0.5 mM – 2 мкл смеси или по 2 мкл раствора каждого нуклеотида,

2. Taq ДНК-полимераза – из расчета 1 единица активности на пробу,

3. ДНК – матрица – раствор с концентрацией ДНК 0.5 -0.05 мкг/мкл с общим количеством ДНК около 1 мкг или 2 – 10 мкл смеси после обратной транскрипции,

4. смесь праймеров – по 10 - 20 пM каждого праймера в объеме 20 мкл,

5. буфер 10х, например, содержащий для Taq-полимеразы следующие компоненты: 670 мМ Трис-НСl рН 8.8, 160 мМ NaHSO4, 15 mM MgCl₂, 0,1% Tween-20 – 2 мкл

6. автоклавированная дистиллированная вода – до объема 20 мкл

7. после перемешивания реакционной смеси, содержащей все компоненты, поверх водного слоя аккуратно наносится 50 мкл минерального (вазелинового) масла для предотвращения испарения при высокой температуре.

Протокол амплификации

Для проведения ПЦР пробирки помещаются в автоматический амплификатор Ампли-4 (фирмы Биоком) или Терцик (фирмы ДНК-технология). Задается программа из 30 – 40 циклов со следующим температурным режимом:

1. Денатурация 94⁰, 0,5 - 1 минута

2. Отжиг 0,5 - 1 минута при температуре отжига, в зависимости от праймеров

3. Элонгация 72⁰, 0.5 – 1 минута.

Реакция занимает несколько часов в автоматическом режиме, после чего реакционная смесь может храниться в холодильнике до следующего занятия.

Для проведения электрофоретического анализа продуктов ПЦР необходимо:

1) Залить гели из легкоплавкой агарозы (концентрация агарозы - 1%; буфер - ТАЕ (0,04 М трис-ацетат - 0,002 М ЭДТА, рН 7,5—8,0) или ТВЕ; бромистый этидий (EtBr) добавляется до конечной концентрации 0,5 мкг/мл (4-5 мкл EtBr с концентрацией 10 мг/мл на 80 мл агарозы),

2) 5 - 20 мкл реакционной смеси после ПЦР смешивается с 1—2 мкл 80%-го глицерина с бромфеноловым синим (БФС) и наносят на агарозный гель в несколько ячеек в разных концентрациях. Рядом наносят

контрольные пробы и какой-либо стандарт для определения размера фрагментов и ориентировачной оценки их концентрации,

3) Электрофорез проводят при напряжении 80—100 В приблизительно 60—90 мин,

4) По окончании электрофореза изучают гель в УФ-излучении на трансиллюминаторе, пользуясь защитным экраном (УФ излучение опасно для глаз!), фотографируют и переводят изображение на компьютер для анализа. Наличие фрагментов ожидаемого размера говорит о наличии вирусов в изучаемых пробах.

Примечание: Как вариант данная работа может проводиться по методу ПЦР в реальном времени (Real Time PCR) с помощью прибора АНК-32. При этом в реакционную смесь для ПЦР (после обратной транскрипции) добавляется дополнительно флуоресцентная олигонуклеотидная проба, комплементарная середине амплифицируемого участка. В этом случае повышается чувствительность и специфичность анализа, а время значительно сокращается. Анализ может быть количественным.

Контрольные вопросы:1. Почему чувствительность иммуноферментных методов выше, чем таких серологических методов, как иммунодиффузия или иммуноэлектрофорез? 2. Какая стадия добавляется при ПЦР-анализе РНК-содержащих вирусов? Зачем она требуется?

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: