Последовательность и правила приготовления питательных сред

Приступая к приготовлению питательных сред, в частности среды Мурасиге-Скуга (МС), нужно учитывать, что:

1. Минеральные среды готовятся в повышенных концентрациях (обычно 10-20-ти кратных) и могут храниться длительное время, а органические компоненты добавляются непосредственно перед стерилизацией и даже в некоторых случаях уже в стерильную среду (например, спиртовые растворы фитогормонов и термолабильных соединений или стерилизованные фильтрованием растворы аминокислот).

2. При приготовлении исходных концентратов минеральных сред соли кальция растворяются отдельно и добавляются к уже готовым средам. Это необходимо в связи с присутствием в составе сред фосфатов и сульфатов, которые могут образовывать с кальцием малорастворимые соли, выпадающие в осадок при высоких концентрациях исходных компонентов.

3. Некоторые микроэлементы используются в следовых количествах, и их навески трудно отобрать, поэтому их готовят в виде растворов с 1000-кратной или еще более высокой концентрацией. Причем желательно, чтобы соли меди и иодистый калий были разделены, так как при высокой концентрации возможна следующая реакция,

приводящая к потере микроэлементов в виде осадка:

4KJ + 2CuSO₄ = 2CuJ¯ + J₂ + 2K₂SO₄

4. В небольшом объеме воды отдельно готовится раствор соли железа и ЭДТА и доводится до кипения для завершения образования хелатного комплекса. Затем раствор прибавляется к концентрату минеральной среды. Таким образом обеспечивается доступность железа для растительных клеток и предотвращается образование малорастворимых солей.

5. После приготовления среды однократной концентрации рН доводится до величины 5,8±0,1 с помощью раствора щелочи. Для большинства учебных задач используются среды, приготовленные на основе минеральной части среды Мурасиге-Скуга (МС), которые отличаются между собой только составом органических компонентов. Среда МС отличается повышенным содержанием элементов питания и полным набором микроэлементов, и обеспечивает максимальную скорость роста для культур большинства видов растений.

Состав среды Мурасиге-Скуга (среда МС) в мг/л:

Макроэлементы: Микроэлементы:

KNO₃ 1900 H₃ВО₃ 6,2

NH₄NO₃ 1650 MnSO₄ х 4Н₂О 22,3

MgSO₄ х 7Н₂О 370 ZnSO₄ х 7Н₂О 8,6

KH₂PO₄ 170 KJ 0,83

CaCl₂ х 2Н₂О 440 Na₂МоО₄ х 2Н₂О 0,25

Na₂ЭДТА 37,3 CuSO₄ х 5Н₂О 0,025

FeSO₄ х 7Н₂О 27,8 СоСl₂ х 6Н₂О 0,025

Органические компоненты:

инозит 100

сахароза 30000

никотиновая кислота 0,5

пиридоксин 0,5

тиамин 0,1

аскорбиновая кислота 1,0

Вся работа с культурой тканей in vitro должна проводиться в стерильных условиях. Поэтому все среды, оборудование, материалы и части растений, помещаемые для культивирования на питательные среды, должны быть простерилизованы с помощью методов, приведенных в таблице 1.

Таблица 1.

Методы стерилизации оборудования и материалов.

Посуда	Инстру-менты	Материалы	Раститель-ный материал	Рабочее место	Питательная среда
1) Сухим жаром в су-шильном шкафу при 160- 170° 2 часа (кроме мерной посуды). 2) Автокла-вированием при давлении 2 атм., 25-30 минут (в т.ч. мерную посуду).	1) Обжиганием в пламени спиртовки в ходе работы. 2) Сухим жаром при 140°, 2 .часа 3) Автокла-вированием. 4) Шприци и сверла путем кипячения.	1) Автокла-вированием при давлении 2 атм., 25-30 мин. (Вата, марля, фильтро-вальная бу-мага, ватные пробки и пр).	1) Ртутными препаратами: 0.1% сулема (HgCi₂) и 0.1% диацид. Семена - 10-15 мин, расту-щие ткани - около 5 мин. 2) 70% спирт, 3) 13-20% Н₂О₂ 4) 3-6% хлорамин 5) 10% гипохлорит натрия	1) Ламина-рный сте-рильный шкаф. 2) УФ об-лучением. 3) 70% спиртом. 4) Работа в стерильной зоне пламени.	1) Автокла-вированием при давлении 1 атм (120°), 15-20 мин. 2) Стерили-зационным фильтрованием через фильтры с порами £ 0.45 мкм 3) Дробным кипячением (3 раза с ин-тервалом в сутки).

Примечания: 1. Для растительного материала применяется только химическая стерилизация. Лучшими стерилизаторами, особенно для нежных растущих тканей, являются препараты ртути, не проникающие в растительные ткани, но требующие отмывки в 4-6 сменах стерильной воды из-за высокой токсичности. 2. 70% спирт даже превосходит по стерилизующей способности 96% и меньше обжигает ткани. Спирт хорошо проникает в ткани растений – время стерилизации листьев 1-2 секунды. 3. Семена стерилизуются дольше – 10-20 минут для всех

стерилизаторов. 4. Холодная стерилизация сред фильтрованием применяется для разлагающихся при нагревании компонентов. Концентрированный стерильный фильтрат вливается в автоклавированный раствор агара.

Цель работы:Приготовление сред для следующих занятий.

Материалы: Пластиковые лодочки для взвешивания, калька, колпачки из фольги для колб или ватно-марлевые пробки; реактивы: неорганические соли, агар-агар, сахароза, гидролизат белка, витамины и фитогормоны.Оборудование. Стаканы химические на 1л, 0.5л по 1шт, на 0.15-0.25л - 4шт., полипропиленовые микропробирки с крышечками на 1.5мл или пенициллиновые флаконы на 10мл - 8-10шт., набор автоматических пипеток (автосамплеров) с диапазоном регулировки 2 – 1000 микролитров, мерные цилиндры на 0.5 и 0.2л. Весы технические и аналитические или торсионные, электроплитка, лабораторный рН-метр.

Ход работы

А. Приготовление минеральной основы среды МС.

Предварительно провести расчеты навесок всех необходимых компонентов среды и занести результаты в таблицу по приведенной ниже форме. В зависимости от массы навески использовать торсионные или технические весы. Все растворы приготовить на дистиллированной воде.

1.Приготовить два концентрированных маточных раствора, содержащих микроэлементы: а) 10мл 100000-кратного раствора, содержащего CuSO₄ и СоСl₂; б) 10мл 10000-кратного раствора KJ и Na₂МоО₄.

2. Взвесить соль железа и ЭДТА - из расчета на 5 литров

готовой однократной среды. Растворить навески в 50 мл воды в маленьком стаканчике и довести до кипения на электроплитке.

3. Навески остальных микроэлементов и макроэлементов, кроме соли кальция, растворить в большом стакане, добавить комплекс соли железа с ЭДТА и довести объем до 0.5л, получая 10-кратный раствор, который перелить в колбу для дальнейшего хранения.

4. Навеску соли кальция также рассчитать на 5литров готовой среды и растворить ее в 100 мл воды.

Маточные растворы	Компоненты	Навески	Конечный объем
Раствор 1а Раствор 1б Раствор 2 Раствор 3 Раствор 4	CuSO₄ х 5Н₂О CoCl₂ х 6H₂O KJ Na₂МоО₄х 2Н₂0 Na₂ЭДТА FeSO₄ х 7Н₂0 KNO₃ NH₄NO₃ MgSO₄ х 7Н₂О KH₂PO₄ H₃ВО₃ MnSO₄ х 4Н₂О ZnSO₄ х 7Н₂О CaCl₂ х 2Н₂O		10мл 10мл 50мл 500мл с учетом прилитого раствора 2 100мл

Примечание: Растворы 1а, 1б, 3 и 4 хранятся длительное время.

Б. Приготовление маточных растворов фитогормонов и витаминов.

1. Взвесить микропробирки, добавить в них небольшое количество кристаллического порошка фитогормона и

снова взвесить. По разнице весов расчитать навеску фитогормона, которая должна составлять от 2 до 7 мг, и по ее точному значению вычислить необходимый объем спирта, чтобы конечная концентрация гормона составила 5 мг/мл. После добавления спирта пробирки закрыть и встряхивать до растворения осадка. Спиртовые растворы являются стерильными и их можно добавлять в среду после ее автоклавирования (некоторые гормоны разлагаются при автоклавировании). При отсутствии аналитических весов отобрать по возможности более точно навеску фитогормона на лодочке из кальки с помощью торсионных весов.

2. Для питательных сред обычно используют аптечные растворы витаминов в ампулах. При их отсутствии приготовить маточные растворы витаминов в микропробирках или пенициллиновых флаконах, растворяя их в воде. Хранить в холодильнике.

В. Приготовление одной из сред, используемых на следующих практических занятиях (по указанию преподавателя).

Согласно прописи состава среды, указанной в тексте соответствующего практического занятия, и необходимого объема среды рассчитать и отобрать навески сахарозы, инозита, пептона и агар-агара.

Агар-агар сразу поместить в колбу, в которой будет проводиться автоклавирование среды, а остальные навески ссыпать в большой стакан. Туда же внести рассчитанные объемы воды, маточных растворов макро- и микроэлементов, и в последнюю очередь добавить раствор CaCl₂ при перемешивании.

2. С помощью автоматического дозатора внести рассчитанные аликвоты растворов витаминов и фитогормонов, используя одноразовые наконечники.

3. Довести рН полученного раствора до 5.8±0.1, добавляя при перемешивании раствор щелочи и контролируя рН с

помощью рН-метра.

4. Перелить раствор в колбу с навеской агара. Закрыть её ватно-марлевой пробкой или колпачком из фольги и проавтоклавировать 20 мин при 1 атм избыточного давления. После автоклавирования неостывший раствор нужно осторожно перемешать для равномерного распределения содержимого колбы и собравшегося на дне расплавленного агар-агара. Если такой возможности нет, то перед автоклавированием нужно раплавить агар-агар на электроплитке в небольшом количестве раствора и влить его при перемешивании в оставшуюся часть холодного раствора.

Контрольные вопросы:

1.В чем состоят различия органов и клеток растений по потребности в элементах питания в условиях in vitro по сравнению с целым растением? 2. Какие группы веществ входят в состав питательных сред для растительных тканей? 3. Перечислите 5 правил приготовления питательных сред. 4. Как можно стерилизовать растительный материал перед началом его культивирования in vitro? 5. Какие существуют способы стерилизации питательных сред? 6. Как обеспечить стерильность на рабочем месте?

123 4

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: