Тема: Основы техники культивирования тканей растений in vitro

Заякин В. В., Нам И.Я.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ IN VITRO

Методическое пособие для лабораторно-практических занятий по курсу

«Введение в биотехнологию»

Брянск

Цельюданного пособия является помощь студентам в практическом освоении методов и приемов культивирования органов и тканей растений in vitro , получения безвирусного растительного материала, а также ознакомление с теоретическими основами этих методов.

Термины, выделенные подчеркнутым шрифтом, кратко поясняются в тексте и предназначены для запоминания студентами. В конце каждой работы даны вопросы для самопроверки.

В конце методических указаний приводится список использованных биологических терминов и рекомендуемая литература.

Рецензенты:Заведующая кафедрой биотехнологии Орловского государственного аграрного университета, доктор биологических наук, профессор Павловская Н. Е.

Профессор кафедры ботаники БГУ им. акад. И. Г. Петровского, доктор сельскохозяйственных наук Кононов А. С.

Рекомендовано к печати Ученым Советом ЕГФ БГУ 23 Декабря 2010 г., протокол №7

Содержание

Тема: Основы техники культивирования тканей растений in vitro

Работа 1 Приготовление питательных сред 2

Тема: Культура каллусной ткани 12

Работа 2 Получение и культивирование каллусной ткани из корнеплодов моркови и клубней картофеля 13

Тема: Клональное микроразмножение растений in vitro 15

Работа 3 Клональное микроразмножение малины, земляники и других культур 16

Работа 4 Введение новых видов и сортов растений в культуру in vitro. Выделение и культивирование точек роста и меристем растений в качестве первичных эксплантов 20

Работа 5. Оздоровление растительного материала от вирусной инфекции. Выделение и культивирование in vitro меристем картофеля 23

Тема: Тестирование вирусов и вироидов в растениях 28

Работа 6. Определение вирусов растений иммуноферментными методами 28

Работа 7. Применение РТ-ПЦР для обнаружения вируса кустистой карликовости малины и других РНК-содержащих вирусов. 29

Тема: Вторичный морфогенез в культуре каллусных тканей растений in vitro 37

Работа 8. Регенерация растений из каллусных культур картофеля и моркови. 39

Работа 9. Регенерация растений из листовых эксплантов малины 41

Список использованных биологических терминов 44

Рекомендуемая литература 45

Тема: Основы техники культивирования тканей растений in vitro

Работа 1. Приготовление питательных сред для культивирования in vitro изолированных органов, тканей и клеток растений. Ознакомление с условиями стерильной работы и методами стерилизации сред, растительного материала, оборудования и рабочего места.

Для обеспечения роста и развития любой растительной ткани или органа растения, независимо от того находятся ли они in situ (то есть на своем месте, на растении) или in vitro (вне растения, в пробирке), требуется как соблюдение внешних физико-химических условий (освещенности, температуры, влажности, кислорода для дыхания, углекислоты для фотосинтеза), так и поступление элементов минерального и органического питания. Целые зеленые автотрофные растения нуждаются только в поступлении элементов неорганического питания, поскольку способны самостоятельно синтезировать все необходимые органические вещества. Однако разные ткани и органы различаются по своим биосинтетическим возможностям, между ними происходит постоянный обмен метаболитами. Некоторые ткани лишены хлорофилла и являются гетеротрофными. Кроме того нужно учитывать, что, как правило, при культивировании растительных эксплантов в закрытых пробирках фотосинтез затруднен, поэтому требуются более сложные по составу среды, обеспечивающие все потребности тканей или органов. Обычно культуральные среды для растительных эксплантов содержат следующие группы компонентов:

1. Неорганические макроэлементы в виде солей (N, P, K, S, Fe, Ca, Mg);

2. Неорганические микроэлементы (Co, Cu, Zn, B, Mo, Mn, J, иногда Ni);

3. Углеводы (чаще всего сахароза, глюкоза);

4. Аминокислоты (отдельные или чаще в виде смеси, получаемой при гидролизе молочного белка казеина и носящей фирменные названия "пептон" или "триптон");

5. Витамины (тиамин В1, пиридоксин В6, аскорбиновая кислота С, никотиновая кислота, и иногда другие);

6. Фитогормоны (обычно цитокинины, ауксины и гиббереллины);

7. Желирующие вещества (наиболее часто агар-агар);

Примечание: вещества 4,5 и 6 групп иногда могут заменяться частично или полностью растительными соками или экстрактами, обычно кокосовой водой, представляющей собой жидкий эндосперм кокосового ореха, богатый разными физиологически активными веществами.

Наличие компонентов первых трех групп является обязательным (иначе ткань перестает расти и погибает), а необходимость присутствия остальных веществ зависит от типа культивируемых тканей и поставленных целей. Углеводы являются основой гетеротрофного питания растений in vitro. Сахароза является главной транспортной формой углеводов у большинства растений. Их клетки и ткани приспособлены для усвоения сахарозы, и поэтому она хорошо поддерживает рост растительных эксплантов и является универсальной составной частью питательных сред. Другие сахара используются реже, обычно в виде добавок наряду с сахарозой.

Аминокислоты и витамины могут синтезироваться растительными тканями в условиях in vitro из сахаров и минеральных веществ, но их добавка может оказывать положительное влияние, особенно когда экспланты

состоят из небольшого числа клеток (например, меристемы при оздоровлении картофеля от вирусов) или когда связь между клетками ослаблена (например, при индукции образования и выращивании каллуса). В этих случаях в среду добавляется пептон и расширенный набор витаминов. При культивировании незрелых зародышей, особенно бобовых культур, накапливающих большое количество запасных белков, в среды для обеспечения достаточной скорости роста добавляется большое количество аминокислот, прежде всего глутамина и аспарагина, являющихся естественными транспортными формами азотных соединений в этих случаях.

Витамины являются коферментами, то есть входят в качестве простетической (небелковой) части в состав активного центра некоторых энзимов, обеспечивая их активность. Поэтому витамины улучшают адаптацию тканей, способствуют их росту. Аскорбиновая кислота является, кроме того, антиокислителем - препятствует окислению фенольных соединений.

Продукты окисления фенолов окрашивают среду и ткани в темный цвет и являются токсичными для растительных клеток. При реальной угрозе их образования содержание аскорбиновой кислоты можно увеличивать в несколько раз. Нужно помнить, что другие витамины могут проявлять фитотоксические эффекты (особенно тиамин) и превышать их концентрации не рекомендуется.

Компоненты среды, относящиеся к группе фитогормонов, играют особенную роль. Они не только стимулируют рост и деление клеток растений, но позволяют также направлять развитие экспланта в нужную сторону. Например, исходя из одного и того же кусочка ткани (экспланта), можно получить корни в присутствии ауксинов, побеги - в присутствии цитокининов или каллус - в присутствии обоих гормонов в определенном соотношении. Кроме ауксина и цитокинина, в составы

питательных сред иногда добавляют гиббереллин, который тоже относится к группе фитогормонов ростстимулирующего типа. Фитогормоны, относящиеся к ингибиторам роста (абсцизовая кислота и этилен), применяются только в особых случаях.

Желирующие вещества добавляют для регуляции консистенции среды, делая ее полужидкой или твердой. Это позволяет помещать растительную ткань на поверхность среды и обеспечивать тем самым одновременно хорошую аэрацию и снабжение элементами питания. Обычно для этих целей применяется агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей, который при охлаждении раствора образует крупноячеистую сетку за счет продольного "слипания" отдельных молекул в тяжи. В результате раствор теряет текучесть и становится твердым. Концентрация агар-агара при этом составляет всего около 0.7%, а при концентрации 0.5% среда становится полужидкой. Агар-агар не ингибирует рост растительных клеток в отличие от некоторых других желирующих агентов. Из неочищенного агар-агара выделены вещества, регулирующие поступление воды в ткани растений, при их недостатке может наблюдаться явление витрификации - ткань поглощает избыток воды, становится прозрачной ("стеклянной"), хрупкой и, в конце концов, погибает. Одним из способов борьбы с витрификацией является повышение концентрации агар-агара. Имеется ряд сообщений об успешном поиске более дешевых заменителей агар-агара, но эти вещества пока недоступны.

Подобрано достаточно большое количество составов питательных сред, сбалансированных по соотношению как минеральных, так органических компонентов. Самой популярной и универсальной минеральной основой для питательных сред является минеральная часть среды Мурасиге-Скуга.

Она характеризуется повышенным содержанием азота, расширенным набором микроэлементов и обеспечивает активный рост тканей растений. Поэтому она является основой для большинства сред, применяемых в практикуме.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: