Культура клеток. Процессы роста и гибели клеток.
Возможно поддержание жизни тканей и органов вне организма путем выращивания их в культуре. Впервые попытки поддержания жизнедеятельности клеток человека и животных в лабораторных условиях были предприняты в 1907 г. Харрионом и в 1912 г. Каррелем. Однако лишь в 1942 г. Ж. Моно предложил современные методы культивирования in vitro.
Культура клеток представляет собой популяцию генотипически однотипных клеток, которые функционируют и делятся in vitro. Культуры клеток, полученные путем целенаправленных или случайных мутаций, называются клеточными линиями.
Рост клеточных культур in vitro имеет сложный характер. В целом выделяют следующие фазы:
1. Индукционный период (лаг-фаза). В течение лаг-фазы не происходит сколько-нибудь заметного увеличения числа клеток или образования продуктов. Данная фаза обычно наблюдается после пересева клеточной культуры. В ней происходит адаптация клеток к новой культуральной среде, перестраивается метаболизм клетки.
2. Фаза экспоненциального роста. Она характеризуется быстрым накоплением биомассы и продуктов жизнедеятельности клеточных культур. В данной фазе наиболее часто встречаются митозы по сравнению с остальными фазами роста. Но в этой фазе экспоненциальный рост не может продолжаться бесконечно долго. Она переходит в следующую фазу.
Рис. 4.2. Клеточная культура Нер-2, 48 часов культивирования, видны митозы.
3. Фаза линейного роста. Характеризуется уменьшением числа митозов
4. Фаза замедленного роста. В этой фазе уменьшается рост клеточной культуры за счет уменьшения числа митозов.
5. Стационарная фаза. Наблюдается вслед за фазой замедления роста, при этом число клеток практически не меняется. В этой фазе либо происходит прекращение митотического деления клеток, либо число делящихся клеток равно числу отмирающих клеок.
6. Фаза отмирания культуры, в которой преобладают процессы гибели клеток и практически не наблюдаются митотические деления.
Последовательные переходы от фазы 1 к фазе 6 наблюдаются в значительной степени за счет истощения субстратов, необходимых для роста популяции клеток, или же за счет накопления токсичных продуктов их жизнедеятельности. Субстраты, ограничивающие рост клеточных культур получили название лимитирующих.
В условиях, когда концентрация субстратов и других компонентов, необходимых для роста клеток постоянна, процесс увеличения числа клеток носит автокаталитический характер. Данный процесс описывается следующим дифференциальным уравнением:
dN/dt = μN,
где N – число клеток, μ – удельная скорость роста.
Рис. 4.3. Клеточная культура RD – рабдомиосаркома человека. Монослой, живые неокрашенные клетки.
Последовательные переходы от фазы 1 к фазе 6 наблюдаются в значительной степени за счет истощения субстратов, необходимых для роста популяции клеток, или же за счет накопления токсических продуктов их жизнедеятельности.
Для поддержания жизни клеток в культуре необходимо соблюдать ряд обязательных условий:
- необходима сбалансированная питательная среда;
- строжайшая стерильность;
- оптимальная температура;
- своевременный пассаж, т. е. пересев на новую питательную среду.
Впервые на лимитирование процессов роста культур клеток субстратами ферментативных реакций обратил внимание Ж. Моно. Субстраты, ограничивающие рост клеточных популяций, получили название лимитирующих.
Практически для всех клеточных популяций характерно изменение скорости роста под действием ингибиторов и активаторов. Выделяют ингибиторы, действующие на ДНК (налидиксоновая кислота), ингибиторы, действующие на РНК (актиномицин Д), ингибиторы синтеза белка (левомицетин, эритромицин, тетрациклин), ингибиторы синтеза клеточной стенки (пенициллин), мембраноактивные вещества (толуол, хлороформ), ингибиторы энергетических процессов (2,4 – динитрофенол), ингибиторы лимитирующего фермента.
Одним из важнейших факторов, определяющих кинетику клеточного роста, являются ионы водорода. Многие клеточные культуры растут в узком диапазоне рН; изменение рН приводит к замедлению их скорости роста или к полному прекращению роста
Одна из первых попыток описать феномен ограничения роста популяций была предпринята П. Ферхгюльстом в 1838 г. Он предположил, что помимо процесса размножения организмов, есть процесс гибели организмов, наблюдаемых из-за «тесноты», т.е. данный процесс происходит при встрече двух индивидов.
В развитии любой клеточной популяции наступает период остановки клеточного роста и гибели клеток. Очевидно, что остановка роста и гибель клеток имеют не меньшее значение, чем их размножение и рост. Особенно эти процессы важны для многоклеточных организмов. Неудержимый и неконтролируемый рост отдельных клеток – причина онкологических заболеваний, остановка роста, старение и гибель клеток – причина старения и смерти организма в целом.
Различные популяции и различные клетки ведут себя совершенно по- разному. Бактериальные клетки и клетки одноклеточных организмов внешне представляются «бессмертными». При попадании в подходящую комфортную среду с избытком лимитирующего субстрата клетки начинают активно размножаться. Ограничение их роста определяется расходом субстрата, накоплением продуктов-ингибиторов, а также специфическим механизмом ограничения роста, который называется «прогрессирующей некомпетентностью».
Клетки многоклеточных организмов ведут себя совершенно по-другому. Дифференцированные клетки составляют органы и ткани, и их рост и размножение принципиально ограничены. Если механизм контроля роста разрушается, возникают индивидуальные клетки, растущие неограниченно. Эти клетки составляют популяцию раковых клеток, их рост приводит к гибели организма в целом.
Исследования проблемы старения «нормальных» клеток многоклеточных организмов имеет весьма интересную историю. Впервые мысль о том, что нормальные соматические клетки животных и человека детерминированно должны терять способность к делению и гибнуть, была высказана великим немецким биологом Августом Вейсманом в 1881 г. Приблизительно в это же время ученые научились переводить клетки животных и человека в культуру. В начале века известный хирург, один из основателей техники культивирования клеток in vitro, лауреат Нобелевской премии Алексис Каррель поставил эксперимент, который продолжался 34 года. В течение этого срока он культивировал клетки фибробластов, полученные из сердца цыпленка. Опыт был остановлен, потому что автор был уверен, что клетки можно культивировать вечно. Эти результаты убедительно демонстрировали, что старение не является отражением процессов, происходящих на клеточном уровне.
Однако этот вывод оказался ошибочным. «Бессмертными» являются перерожденные (трансформированные) клетки, потерявшие контроль роста и превратившиеся в раковые. Лишь в 1961 г.Л. Хейфлик, вернувшись к опытам А. Карреля, показал, что нормальные «не трансформированные» фибробласты человека способны провести около 50 делений и полностью прекратить размножение. В настоящее время нет сомнений, что нормальные соматические клетки обладают ограниченным репликационным потенциалом.
Для определения совокупности процессов «программированного» старения и гибели клеток был предложен термин «апоптоз». Апоптоз следует отличать от некроза – гибели клеток за счет случайных событий или под действием внешних токсинов. Некроз приводит к попаданию содержимого клетки в окружающую среду и в норме вызывает воспалительную реакцию. Апоптоз – это фрагментация содержимого клетки изнутри, осуществляемая специальными внутриклеточными ферментами, индукция и активация которых происходит при получении клеткой внешнего сигнала или при принудительной инъекции в клетку ферментов – активаторов апоптозной «машины», или при повреждении клетки внешними факторами, не приводящими к некрозу, но способными инициировать апоптоз (ионизирующая радиация, обратимый перегрев и др.).
Современный интерес исследователей к апоптозу очень велик, он определяется осознанием важной роли апоптоза в поведении клеточных популяций, т.к. его роль не меньше, чем роль процессов роста и размножения клеток.
Концепция «программируемой» клеточной смерти существовала очень долго, однако лишь в 1972 г. после работы Керра, Вилли и Куррье, в которой было показано, что многие процессы «программируемой» и «непрограммируемой» клеточной гибели совершенно близки, интерес к апоптозу сильно возрос. После того, как была показана роль в апоптозе процессов деградации ДНК и во многих случаях необходимый синтез de novo РНК и специфических белков, апоптоз стал предметом биохимии и молекулярной биологии.
Молекулярная биология апоптоза весьма разнообразна. Апоптоз изучают по морфологическим изменениям клеток, по индукции, активности и появлению продуктов трансглутаминазы, «сшивающей» белки, по фрагментации ДНК, по изменению потоков кальция, по появлению на мембране фосфатидилсерина.
В 1982 г. С.Р. Уманский предположил, что одной из функций программы клеточной гибели эукариотических клеток является элиминация постоянно возникающих клеток с онкогенными свойствами. Подтверждением этой гипотезы является открытие белка р53 – индуктора апоптоза и опухолевого супрессора. Белок р53 является регулятором транскрипции, способным узнавать специфические последовательности ДНК. Ген р53 активирует несколько генов, задерживающих деление клетки в G1-фазе. После действия факторов, повреждающих ДНК (радиация, УФО) экспрессия гена р53 в клетках существенно усиливается. Под влиянием р53 клетки, имеющие множественные разрывы ДНК, задерживаются в фазе G1, а если входят в S-фазу (например, в случае трансформации опухолей), то подвергаются апоптозу.
Мутация гена р53 позволяет клеткам с поврежденной ДНК завершить митоз, сохраняет клетки, подвергшиеся опухолевой трансформации, при этом они оказываются резистентными к лучевой и химиотерапии. Мутантная форма белка р53 не обладает способностью останавливать клеточный цикл.
Наиболее распространенная в настоящее время концепция «программируемого» старения основана на представлении о теломере. Дело в том, что ДНК-полимераза не способна реплицировать «хвосты» 3/ - конца матрицы ДНК – несколько нуклеотидов на 3/ - конце. Многократная репликация ДНК в процессе размножения клеток в этом случае должна приводить к укорачиванию считываемой области. Это укорочение и может быть причиной старения и падения репликационного потенциала, ухудшения функционирования хромосом. Для предотвращения этого процесса специфический фермент теломераза синтезирует на концах ядерной ДНК многократно повторяемый гексануклеотид TTAGGG, образующий протяженный участок ДНК, называемый теломерой. Фермент теломераза был предсказан в 1971 г. А. Оловниковым и открыт в 1985 г. Грейдером и Блэкберном.
В большинстве клеток нормальных тканей человека теломераза неактивна, и поэтому клетки подвергаются апоптозу через 50 – 100 делений, считая от их образования из клетки-предшественницы. В клетках злокачественных опухолей ген теломеразы активен. Поэтому, несмотря на свою «старость» по количеству пройденных клеточных циклов и накопление большого количества мутационных изменений в структуре ДНК, продолжительность жизни злокачественных клеток почти не ограничена. Для преодоления укорачивания генома и старения согласно этим представлениям клетка должна активировать теломеразный ген и экспрессировать большее количество теломеразы.
Рост клеточных популяций ограничен рядом факторов, приводящих к существованию предела в накоплении клеточной биомассы. Для клеток животных и растений ограничение роста является жизненной необходимостью, т.е. рост многоклеточных организмов ограничен. К наиболее важным факторам, ограничивающих рост клеточных популяций относятся:
1. Истощение системы по лимитирующему субстрату;
2. Появление в популяции клеток, потерявших способность к делению.
3. Накопление продуктов, являющихся сильными ингибиторами роста.
Ограничение роста клеточной популяции может иметь специфический характер запрограммированного отказа. Биохимические механизмы, останавливающие пролиферацию клеток, имеют, по-видимому, различную природу. В настоящее время ясно, что в ряде случаев остановка роста связана с потерей чувствительности клеток к ростовым факторам среды. В качестве примера можно привести особенности роста популяции лимфоцитов, индуцированного действием ростовых факторов. Например, динамика появления и исчезновения на клеточной мембране Т-лимфоцитов рецептора к фактору роста характеризуется тем, что быстрая экспрессия рецептора сменяется стадией его потери. Возможно, что «десенситизация» рецептора к ростовому фактору связана с механизмом его инактивации в процессе реакции.
Для получения культуры лучше всего использовать свежие клетки, взятые из тканей взрослого человека, эмбриона и даже из злокачественных опухолей. В настоящее время получены культуры клеток легкого, кожи, почки, сердца, печени и щитовидной железы. Клетки выращивают на твердых или жидких питательных средах в виде монослойной культуры, например на стекле, или в виде суспензии во флаконах или специальных приборах - ферментерах.
В настоящее время для изучения механизмов, лежащих в основе роста и развития клеточных популяций все шире применяются методы математического моделирования с использованием вычислительной техники. С одной стороны, эти подходы обеспечивают возможность фундаментального исследования динамики процессов с учетом всей совокупности эффектов, усложняющих рост популяции, с другой – позволяют вести обоснованный поиск технологических режимов, тонкого управления процессом роста клеток.
Продолжительность жизни некоторых штаммов клеток в культуре может достигать более 25 лет. Однако по данным Hayflick (1965) продолжительность жизни клеток в культуре не превосходит продолжительность жизни того вида организма, от которого они взяты. При большой продолжительности содержания клеток в культуре они могут перерождаться в раковые. Так, например, старение диплоидных фибробластов человека в культуре тканей соответствует старению целого организма. Легче поддерживать культуру клеток мало дифференцированных или недифференцированных тканей - клеток лимфоцитов, фибробластов, некоторых эпителиальных клеток. Плохо растут на питательных средах высокодифференцированные и узко специализированные клетки внутренних органов (печени, миокарда и др.).
Метод культуры тканей имеет большое значение для изучения злокачественных опухолей и их диагностики, изучения закономерностей регенерации (пролиферации, факторов регенерации и т. д.), для получения чистого продукта деятельности клеток (ферментов, гормонов, лекарственных препаратов), для диагностики наследственных заболеваний. Культура клеток широко используется в генетической инженерии (выделение и перенос генов, картирование генов, получение моноклональных антител и т.д.). На клеточных культурах изучается мутагенность и канцерогенность различных химических и биологических соединений, лекарственных препаратов и др.
В настоящее время невозможно представить выделение и исследование вирусов без применения клеточных культур. Первое сообщение о размножении вируса полиомиелита на клеточных культурах появилось в 1949 г. (Enders J.F. et al.). Клеточные культуры в вирусологии применяются для следующих целей: 1) выделения и идентификации вирусов; 2) обнаружения вирусной инфекции по значительному увеличению количества антител в парных сыворотках; 3) приготовления антигенов и антител для использования в серологических тестах. Основными источниками тканей для получения однослойных культур служат ткани животных, например, почки обезьян, злокачественные опухоли человека, ткани зародыша человека.
Важную роль в исследованиях макрофагальной системы также играет метод искусственного культивирования. Исследуется роль этой системы в инфекционном процессе, в образовании антител, метаболизме пигментов крови, в нарушениях липидного обмена, в метаболизме химиотерапевтических препаратов, биохимические и биофизические свойства, а также неопластические потенции этих клеток. Большая часть этих исследований обобщена в монографии Нельсона (Nelson D.S., 1969). В чистой культуре макрофаги впервые выделили в 1921 г. Каррел и Эбелинг из крови курицы. Поскольку многие работы, выполненные на макрофагах, имеют отношение к проблемам физиологии и патологии человека, желательно проводить такие исследования на культурах макрофагов человека или млекопитающих, хотя макрофаги млекопитающих не размножаются на искусственной питательной среде. Доступным источником макрофагов может служить кровь, но выход макрофагов мал. Наиболее широко используемым источником макрофагов является перитонеальная жидкость. Она содержит много макрофагов и обычно свободна от других клеток. Много свободных макрофагов присутствует в легких (альвеолярные макрофаги). Их получают путем смывов из альвеол и воздухоносных путей кролика.
Анализ кариотипа человека невозможен без применения культуры клеток. С этой целью исследуют лимфоциты крови, селезенки, лимфоузлов, клетки костного мозга, фибробласты человека и клетки амниотической жидкости. Для стимуляции митозов лимфоцитов в культуральную среду добавляют фитогемагглютинин. Рост клеток длится 48 – 72 часа. За 4 – 6 часов до конца культивирования в среду добавляют колхицин, который останавливает делящиеся клетки в метафазе, т.к. подавляет образование веретена деления. Для того, чтобы получить хороший разброс хромосом на метафазных пластинках, клетки обрабатывают гипотоническим раствором (0,17%) хлорида натрия или другими растворами.
Для диагностики многих биохимических и цитогенетических дефектов зародыша в последние годы широко используется культура клеток зародыша, полученная при трансабдоминальном амниоцентезе. Амниоцентез проводят между 15 – 18 нед. беременности. Клеточная популяция амниотической жидкости в этот период состоит главным образом из слущенных клеток эктодермального происхождения: из клеток амниона, эпидермиса кожи, а также эпителия потовых и сальных желез, ротовой полости и частично пищеварительного тракта и моче - половых путей и других частей зародыша. В 1956 г. появились сообщения об определении хромосомного пола плода на основании исследования полового хроматина в клетках амниотической жидкости. В 1963 г. Фукс и Филип получили культуру клеток амниотической жидкости. В настоящее время используют несколько методов получения культур клеток амниотической жидкости. Обычно для анализа берут 10 мл пробы жидкости, центрифугируют, осадок клеток ресуспендируют и высевают в пластиковые флаконы или чашки Петри в специальную среду. Рост становится заметным через несколько дней. После пересева суспензию клеток на 14 – 21 сутки используют для получения метафазных пластинок.
Большая часть современных знаний по молекулярной биологии, молекулярной генетике, генетической инженерии была получена на основе изучения клеточных культур микроорганизмов. Это определяется тем, что микроорганизмы и клеточные линии относительно легко культивируются, процесс генерации нового поколения занимает от десятков минут до нескольких часов по сравнению с макроорганизмами, для роста которых требуются годы и десятилетия. Вместе с тем сценарии развития близки для всех популяций, развивающихся в закрытых системах.
Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:
©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.
|