Получение лимонной кислоты 3 глава

Суспензию отдельных клеток получают обработкой размельченной ткани эмбриона пищеварительным ферментом трипсином. Если клеткам в такой суспензии дать осесть на плоскую поверхность в сосуде с питательной средой, то клетки становятся плоскими и делятся, образуя монослой. В обычной методике культивирования пользуются цилиндрическими бутылями, которые медленно вращаются вокруг своей длинной оси. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель – микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются. Деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки (для сравнения – клетки дрожжей делятся каждые 1,5-2 ч, а бактериальные клетки – каждые 20-60 мин). Клетки млекопитающих нуждаются в многочисленных питательных веществах, поэтому в питательную среду следует добавлять смесь аминокислот, пуринов и пиримидинов для синтеза белков и нуклеиновых кислот, глюкозу в качестве источника углерода и энергии, витамины и минеральные соли для поддержания необходимого осмотического давления и значения рН, близкого к 7,2. Среда также должна содержать небольшие концентрации антибиотиков для подавления роста бактерий и 5-20 % сыворотки (из крови человека или из плода крупного рогатого скота). Для оптимального роста температуру культуры необходимо поддерживать около 37 ºС, так как ниже 36 ºС клетки либо делятся крайне медленно, либо не делятся вовсе; при температуре выше 38 ºС погибают. Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранять неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при - 180 ºС.

Особенности культивирования растительных клеток

Культивирование растительных клеток в крупных масштабах было освоено в 1976 г. японскими исследователями, которым удалось получить растительную биомассу в объеме 20 м³. Получение массы растительных клеток обходится намного дороже, чем равное количество бактериальных или дрожжевых клеток. Поэтому ученые стараются избежать разрушения клеток с целью извлечения из них полезных для человека соединений. В связи с этим, растительные клетки иммобилизуют внутри пористых полимеров. Доказано, что в таком состоянии клетки удается поддержать жизнеспособными в течение нескольких сотен дней. Проблемой остается извлечение метаболитов в том случае, когда они синтезируются внутри клеток, а не выделяются в среду.

Культуры растительных клеток применяют для синтеза различных веществ: алкалоидов и других вторичных метаболитов, фитогормонов (регуляторов роста растений) и т.д.

Использование растительных клеток является перспективным направлением биотехнологии, так как клетки, растущие в культуре, способны синтезировать вещества, которые не обнаруживаются в целом растении.

Вопросы для самопроверки

1. Назовите основные стадии роста микроорганизмов.

2. Что необходимо для выращивания любой клеточной культуры ?

3. Какие продукты микробного брожения и метаболизма Вы знаете ?

4. Какие соединения - первичными или вторичные метаболиты – необходимы для роста микроорганизмов ?

5. Перечислите отходы пищевой промышленности, широко используемые в качестве сырья для биотехнологического производства.

6. Назовите компоненты, которые обязательно должны присутствовать в питательной среде.

7. Для чего в состав питательных сред вводят источники азота и фосфора ?

8. Что такое ферментация (культивирование) ?

9. Перечислите способы культивирования микроорганизмов.

10. В чем особенности периодического способа ферментации ?

11. Где применяется данный способ ?

12. Каковы особенности промежуточных способов культивирования ?

13. В чем преимущество непрерывного способа культивирования ?

14. В чем отличие хемостата от турбидостата ?

15. Что такое иммобилизованные клетки, и каковы преимущества их применения ?

16. Расскажите об особенностях культивирования животных и растительных клеток.

ТЕМА 3. ОБЩАЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА

ПРОИЗВОДСТВА ПРОДУКТОВ МИКРОБНОГО СИНТЕЗА

Процессы биотехнологических производств разнообразны, но все они имеют пять общих основных стадий, которые могут различаться в зависимости от целевого продукта и способа его получения. Основные стадии следующие: приготовление питательной среды; получение посевного материала; культивирование микроорганизмов; выделение целевого продукта; очистка целевого продукта. Общая биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза приведена на рис. 3.1.

3.1. Приготовление питательной среды

Задача специалиста, оптимизирующего состав среды для конкретного вида микроорганизма, - выбрать такие источники углерода, азота, фосфора и других веществ, которые наиболее оправданы в экономическом и экологическом отношениях.

Принцип составления питательных сред. Каждый конкретный вид микроорганизмов, используемых в биотехнологии, строго избирателен к питательным веществам. Потребность микроорганизма в тех или иных соединениях определяется физиологическими особенностями данного вида микроба, но во всех случаях среда должна быть водным раствором этих веществ и обеспечивать в определенном количестве их приток в клетку.

В самом приближенном виде физиологические потребности микроорганизма в питательных веществах можно выявить, определив химический состав микробной клетки. Однако в этом случае не учитываются количество и состав метаболитов, удаленных клеткой во внешнюю среду, и то обстоятельство, что состав клеточного вещества микроорганизма зависит от состава среды обитания и варьирует в достаточно широких пределах. Но все же, первоначальную ориентировку в выборе оптимального состава питательной среды, исходя из состава клеточного вещества микроба, сделать можно.

Важнейшим условием приготовления питательных сред является соблюдение правиласептики. Для обеззараживания питательных сред применяют, как известно, химическое воздействие (дезинфекцию), воздействие температуры и других физических факторов (ультразвука, ультрафиолетовых лучей, ультрафильтрации). Каждый из этих методов весьма избирателен. В биотехнологии широко применяют термические методы обеззараживания питательных сред (автоклавирование, стерилизацию, кипячение и др.). Споры микроорганизмов более устойчивы к высокой температуре, поэтому именно споры бактерий являются лимитирующим фактором, определяющим температурные режимы стерилизации сред.

Для стерилизации воздуха в случае аэробных процессов культивирования используют фильтрование и ультрафиолетовое облучение.

Продуцент		Подготовка посевного материала		Питательная среда
		Культивирование
		Разделение
Культуральная жидкость				Клетки
		Биомасса убитых клеток		Биомасса живых клеток
Дезинтеграция убитых клеток
Выделение и очистка метаболитов
Концентри-рование		Концентри- рование		Концентри- рование
Стабилизация продукта		Стабилизация продукта		Стабилизация продукта
Обезвоживание		Обезвоживание		Обезвоживание

Хранение

Применение

Рис. 3.1. Принципиальная биотехнологическая схема производства

продуктов микробного синтеза

3.2. Получение посевного материала

Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - ключевая задача любого биотехнологического производства. Культуры микроорганизмов-продуцентов заводы получают из коллекций в пробирках на агаризованных питательных средах или в ампулах. Чистая культура микроорганизма может постоянно или по мере необходимости использоваться в производстве. При длительном хранении чистых культур могут происходить случайные нерегулируемые мутации. Для избежания мутаций следует не только соблюдать правила хранения и поддержания исходной культуры, но и периодически проводить пересев культуры и проверку ее однородности как по морфологическим, так и по физиологическим признакам.

Посевным материалом (инокулятом) называют чистую культуру микроорганизма, которую получают путем ее последовательного пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема до количества, необходимого для промышленного производства. Сначала чистую культуру размножают в лаборатории, затем в цехе чистых культур и инокуляции, далее направляют на культивирование. Приготовление посевного материала состоит из следующих стадий:

1. Получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории завода.

2. Выращивание микроорганизмов в малом посевном аппарате.

3. Выращивание микроорганизмов в большом посевном аппарате.

4. Накопление культуры микроорганизмов в малом ферментере.

Передачу чистых культур из одного аппарата в другой осуществляют в конце логарифмической фазы роста. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.

В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты (грамположительные бактерии, не образующие спор), бактерии и водоросли в виде чистых и смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов – монокультурам (чистым культурам), выращиваемых в асептических условиях. Большинство используемых сегодня культур получено из природных источников, однако затем эти культуры были улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов), или с помощью мутагенеза или генетической инженерии (для производства вторичных метаболитов).

3.3. Ферментация (культивирование)

Это самый важный и продолжительный этап биотехнологического производства. Ферментация представляет собой совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную питательную среду посевного материала до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпывания питательных веществ среды. Существует два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение ценных веществ (метаболитов), возникающих в ходе роста или на последующих стадиях развития культуры.

Как говорилось ранее (п. 2.1), для выращивания любой культуры необходимы: жизнеспособный посевной материал; источники энергии и углерода; питательные вещества для синтеза биомассы; отсутствие ингибиторов роста; соответствующие физико-химические условия.

На оптимальной питательной среде при благоприятных значениях рН и температуры, при условии подачи требуемого количества воздуха в среду микроорганизмы быстро начинают расти и размножаться, обеспечивая накопление биомассы продуцента и биологически ценных метаболитов в культуральной жидкости. Способы ферментации мы рассматривали ранее в разделе 2.4.

Для культивирования микроорганизмов в промышленных масштабах применяют ферментеры (или ферментаторы) – реакционные емкости, в которых при определенных условиях находятся микроорганизмы. Основное назначение ферментатора – своевременно обеспечить микробные клетки необходимыми питательными веществами и кислородом (при необходимости) и отвести продукты обмена веществ, создать однородный состав среды при условии слабого потока культуральной жидкости (при непрерывном культивировании). Для поддержания кислородного режима ферментатор снабжается устройством подвода воздуха, для лучшего перемешивания среды – мешалками различной конструкции. Для поддержания температуры среды предусмотрены системы охлаждения.

3.4. Выделение целевого продукта

Стадия выделения продукта существенно зависит от того, накапливается продукт в клетках или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Разделение биомассы и культуральной жидкости - сепарация - осуществляется несколькими методами.

Если целевым продуктом является биомасса клеток, применяют следующие методы выделения: отстаивание, фильтрация, флотирование, сепарирование и т.д. (механические способы); выпаривание и сушка (физические способы).

Фильтрация– простой и широко применяемый процесс разделения твердых частиц и жидкости, скорость которого зависит от пористости фильтрующего материала и давления. Фильтрование при помощи вакуумных насосов существенно ускоряет процесс.

Флотирование применимо для выделения дрожжевых клеток. Процесс флотирования клеток осуществляется путем вспенивания культуральной жидкости. Вместе с пеной из культуральной жидкости удаляется и основная масса дрожжей.

Сепарирование осуществляют в сепараторах, в которых на клетки действует центробежная сила, отбрасывающая клетки к периферии сосуда, а культуральная жидкость будет собираться в центре сепаратора. Этот процесс протекает гораздо быстрее, чем отстаивание клеток под действием силы тяжести.

Если целевой продукт содержится в самих клетках, то проводят разрушение клеток - дезинтеграцию– физическими, химическими и ферментативными методами.

К физическим методам можно отнести разрушение клеток под действие ультразвука, замораживания-оттаивания, баллистическую дезинтеграцию. Баллистическая дезинтеграция клеток осуществляется в мельницах, куда помещают суспензию клеток и вспомогательные мелющие вещества: песок, стеклянные или полимерные шарики.

К химическим методам дезинтеграции относят разрушение клеток с помощью толуола, бутанола и других химических соединений.

При использовании ферментативной дезинтеграции клеток используют ферменты, способные разрушать определенные структурные компоненты клеточных стенок микроорганизмов. Например, для разрушения бактериальных клеток применяют лизоцимы яиц, бактерий, актиномицетов или грибов. Для разрушения дрожжей и плесневых грибов используются фосфоманназа и бета-глюконаза или применяют автолиз. Автолиз – разрушение клеток дрожжей или плесневых грибов под действием собственных гидролитических ферментов. Для этого суспензию клеток инкубируют при 35-45 ˚С.

Выделение продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции, кристаллизации или сорбции.

Осаждение в виде нерастворимых солей производят путем добавления химического осадителя в эквимолярных количествах. Применяют при получении лимонной, молочной кислоты.

Экстракция – добавление к раствору экстрагента (растворителя), который поглощает целевой продукт. Затем эмульсию разделяют и выделяют целевое вещество. Используют при получении витаминов, антибиотиков.

Кристаллизация – после предварительной обработки культуральной жидкости и выпаривания при охлаждении осуществляют кристаллизацию. Данный метод выделения и очистки используется при получении глутаминовой, итаконовой и других кислот.

Затем выделенный продукт концентрируют центрифугированием, ультрафильтрацией, выпариванием или обратным осмосом.

Центрифугирование – расслоение раствора с частицами бόльшей плотности на осадок и надосадочную жидкость при воздействии центробежной силы.

Ультрафильтрация – обработка раствора на мембранных фильтрах с определенным размером пор (то есть разделение веществ на фракции по размерам их молекул). Применяется для ферментов и других белков.

3.5. Очистка целевого продукта

Эта стадия необходима при получении очищенного целевого продукта, например, ферментных препаратов степени очистки более двухкратной. Эта стадия приводит к росту себестоимости получаемого целевого продукта.

Для очистки ферментов применяют избирательную сорбцию (связывание) каолином, трифосфатом кальция, гидроксидом алюминия и другими адсорбентами. Таким образом проводят сорбцию либо фермента, либо балластных белков, которые затем разделяют центрифугированием. Фермент из сорбента отделяют раствором фосфатного буфера.

На последнем этапе продукт отделяют от примесей, концентрируют и стабилизируют. После стабилизации продукта в зависимости от того, каким должен быть конечный продукт: сухим или жидким, его обезвоживают или сразу упаковывают и отправляют на хранение и далее - потребителю.

Вопросы для самопроверки

1. Перечислите основные стадии биотехнологической схемы получения продуктов микробного синтеза.

2. Как определить физиологические потребности микроорганизмов в питательных веществах ?

3. Какие методы применяют для обеззараживания питательных сред в биотехнологическом производстве ?

4. Опишите последовательность получения посевного материала для промышленного производства целевого продукта.

5. Основное назначение ферментера.

6. От чего зависит проведение стадии выделения целевого продукта ?

7. Какие методы применяют для отделения биомассы клеток от культуральной жидкости ?

8. Что такое дезинтеграция, в каких случаях ее осуществляют ?

9. Расскажите об основных методах дезинтеграции клеток.

10. В чем отличие сепарирования от центрифугирования ?

11. В каких случаях выполняется стадия очистки целевого продукта ?

12. Что такое сорбция ?

ТЕМА 4. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО

ВЕЩЕСТВ И СОЕДИНЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ

В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Как говорилось ранее (п. 2.2), продуктами микробного брожения и метаболизма являются первичные метаболиты, вторичные метаболиты, ферменты и сама клеточная биомасса. Рассмотрим более подробно получение полезных для человека веществ с помощью биотехнологии.

4.1. Получение пищевых кислот с помощью микроорганизмов

Пищевыми принято называть 4 органические кислоты: лимонную, молочную, уксусную и винную. Иногда к ним причисляют яблочную и глутаминовую. Первые три пищевые кислоты получают с помощью микробного синтеза. Винную кислоту также можно получать этим способом, однако до сих пор эту органическую кислоту выгодно получать химическим путем из винного камня.

Получение органических кислот с помощью микроорганизмов началось в 20-30 гг. ХХ века. Пищевые кислоты до этого выделяли в ограниченном количестве из естественных источников. Лимонную кислоту – из сока лимонов, винную – из винного камня (отхода винодельческого производства).

Современное производство органических кислот, существующее в большинстве развитых стран, основано на использовании в качестве продуцентов различных штаммов плесневых грибов, чаще всего рода Aspergillus. С помощью микроорганизмов возможно получение более 50 различных органических кислот: лимонной, уксусной, итаконовой, глюконовой (аэробной ферментацией), молочной и пропионовой (анаэробным способом). Все органические кислоты являются промежуточными или конечными продуктами катаболизма углеводов. Основным механизмом регуляции их образования является лимитация роста продуцента факторами среды.

Получение лимонной кислоты

Лимонная кислота (С₆Н₈О₇) - трехосновная оксикислота, широко распространена в природе, относительно много ее содержится в некоторых ягодах, фруктах, особенно в цитрусовых (в лимоне 5-10 %), в листьях и стеблях некоторых растений.

Ранее лимонную кислоту выделяли в виде лимоннокислого кальция из продуктов переработки листьев хлопчатника, стеблей махорки, хвои ели и в значительных количествах из плодов лимонов. Однако это производство является крайне дорогим и небольшим по объему. Поэтому лимонная кислота была дефицитным и дорогим продуктом.

В настоящее время лимонная кислота по объему производства является одним из главных продуктов микробного синтеза, ее общий выпуск в разных странах достигает до 400 тыс. тонн в год.

В начале нашего столетия рядом исследователей было замечено, что некоторые плесневые грибы обладают способностью образовывать заметные количества органических кислот. В дальнейшем путем отбора и направленной селекции были выделены активные продуценты органических кислот.

Для получения лимонной кислоты используют микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Ustina и др. В настоящее время основными продуцентами лимонной кислоты являются различные штаммы гриба Aspergillus niger, которые отличаются большой скоростью роста, легкостью культивирования и высоким выходом лимонной кислоты по отношению к массе окисляемого углевода. Они устойчивы к внешним воздействиям и имеют обильное конидиеношение. Споры грибов для получения лимонной кислоты хранят только в сухом виде.

Образование лимонной кислоты осуществляется в цикле трикарбоновых кислот в результате конденсации оксалоацетата и ацетил КоА при участии фермента цитрат-синтетазы (рис. 4.1.).

С₆Н₁₂О₆

Глюкоза

СН₃ - СО - СООН СН₃ - СО - СООН

Пируват Пируват

- СО₂ + СО₂

СН₃ - СО - S - КоА + НООС - СН₂ - СО - СООН

Ацетил КоА Оксалоацетат

Н₂С - СООН

НО - С - СООН

Н₂С - СООН

Лимонная кислота

Рис. 4.1. Схема синтеза лимонной кислоты

Необходимые для реакции оксалоацетат и ацетил КоА образуются из двух молекул пирувата: одна молекула пирувата подвергается декарбо-ксилированию с образованием ацетил КоА, вторая - карбоксилируется, давая оксалоацетат. Пируват образуется по фруктозо-бифосфатному пути (пути гликолиза, Эмбдена, Майергофа-Парнаса). Все ферменты этого пути, а также пируватдегидрогеназа, пируваткарбоксилаза и цитрат-синтетаза обнаружены у A. niger. В результате рассмотренной реакции одна молекула сахара (С₆Н₁₂О₆) превращается в одну молекулу лимонной кислоты (С₆Н₈О₇).

Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста грибов-продуцентов минеральными компонентами среды и одновременном избыточным содержанием источника углерода. В условиях лимитирования роста гриба недостатком железа и марганца после полного поглощения из среды дефицитного элемента он прекращает расти, однако продолжает потреблять имеющийся в среде источник углерода. При этом в клетках гриба начинает накапливаться лимонная кислота, которая в дальнейшем выделяется в среду.

Общая технологическая схема производства лимонной кислоты включает следующие этапы:

1. Подготовка питательной среды. Мелассу загружают в варочный котел, разбавляют водой до определенной концентрации углеводов (16 %), добавляют источники азота, фосфора и микроэлементы. Устанавливают необходимое значение рН среды (6,8-7,2) добавлением кислоты или щелочи. Для осаждения солей тяжелых металлов (железа, магния и т.д.), находящихся в мелассе, ее раствор обрабатывают желтой кровяной солью. Затем среду стерилизуют и охлаждают до температуры ферментации.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: