Методы клонирования генов.

Клонирование днк (клонирование генов) – процесс выделения заданной последовательности днк и получения многих её копий in vitro. клонирование днк часто применяют для амплификации фрагментов, содержащих гены, а также любые другие последовательности – например, промоторы, некодирующие последовательности, химически синтезированные олигонуклеотиды и случайные участки днк.

1. Рестрикция - разрезание ДНК человека рестрикционной эндонуклеазой (рестриктазой) на множество различных фрагментов, но с одинаковыми липкими концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.

2. Лигирование - включение фрагментов ДНК человека в плазмиды благодаря сшиванию липких концов ферментом лигазой.

3. Трансформация - введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет их отделить от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высевают на студнеобразную питательную среду, предварительно разведя их так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.

4. Скрининг - отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченным зондом. Зонд - это полинуклеотид, комплементарный части искомого гена. Он гибридизуется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку и через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке, образовавшихся из-за радиоактивной метки зонда, позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном

292.
КАРИОТИП — совокупность признаков хромосомного набора организма (количество хромосом, их форма и размеры)
АУТОСОМЫ - парные хромосомы, одинаковые для мужских и женских организмов. В клетках тела человека 44 аутосомы (22 пары).
ПОЛОВЫЕ хромосомы - хромосомы, содержащие гены, определяющие половые признаки организма.
МОРФОЛОГИЯ хромосом различна в отдельных фазах клеточного цикла. В пресинтетическойфазе Х. представлены одной нитью (хроматидой), в постсинтетической фазе состоят из двуххроматид. В интерфазе Х. занимают весь объем ядра, образуя так называемый хроматин.Плотность хроматина в разных участках ядра неодинакова.
Темные(плотные) участки- ГЕТЕРОХРОМАТИН, эти участки сильно спирализованны, поэтому нечитаемы, в них нах-ся НЕактивные гены.
Светлые(рыхлые)участки- ЭУХРОМАТИН, эти участки деспирализов.,поэтому читаемы, в них нах-ся активные гены.

293.
Секвенирование- (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности (от лат. sequentum — последовательность). В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде.
Рестрикционный анализ [лат. restrictio — ограничение] — установление мест расщепления одной или несколькими рестриктазами конкретной нуклеотидной последовательности ДНК.

294) Генетическая структура популяции, определяемой генофондом популяции, частотами генов и генотипов. Необратимое изменение генетической структуры популяции, которое может произойти под влиянием различных факторов, называют элементарным эволюционным явлением.

Популяция – это совокупность особей одного вида свободно скрещивающихся между собой, характеризующаяся общностью происхождения, местообитания и приспособления к данным условиям жизни. Такие популяции называются панмиктическими. Изучить генетическую структуру популяции – это значит определить, какие генотипы и в каком отношении составляют популяцию, а также с какой частотой в ней встречаются различные аллели.

Наследственная, генотипическая, изменчивость в природных популяциях проявляется в изменениях у населяющих популяцию организмов целого ряда признаков, которые передаются по наследству. Например, у животных одной популяции возникают различия в размерах, окраске, плодовитости и т. п. У растений появляются махровые венчики цветков; рассеченные или цельные листья; пирамидальные или плакучие кроны.

В идеальной популяции действует закон Харди- Вайнберга – закон генетического равновесия, по которому соотношение частот доминантных и рецессивных аллелей одного и того же гена остается неизменным из поколения в поколение.

Идеальная популяция Реальные популяции 1. Численность популяции бесконечно большая, и случайная элиминация (гибель) части особей не влияет на структуру популяции. 2. Отсутствует половая дифференцировка, женские и мужские гаметы равноценны. 3. Наличие панмиксии – свободного скрещивания; равновероятность встречи гамет и образования зигот независимо от генотипа и возраста родителей. 4. В популяции отсутствуют мутации. 5. В популяции отсутствует естественный отбор. 6. Популяция изолирована от других популяций этого вида.

Закон Харди-Вайнберга формулируется следующим образом:
в идеальной популяции соотношение частот аллелей генов и генотипов из поколения в поколение является величиной постоянной и соответствует уравнению:

p² +2pq + q² = 1
где p² — доля гомозигот по одному из аллелей; p — частота этого аллеля; q² — доля гомозигот по альтернативному аллелю; q — частота соответствующего аллеля; 2pq — доля гетерозигот.

Что значит “соотношение частот аллелей генов” и “соотношение генотипов” – величины постоянные? Чему равны эти величины?

Пусть частота встречаемости какого-либо гена в доминантном состоянии (А) равна p, а рецессивного аллеля (а) этого же гена равна q (можно и наоборот, а можно и вообще одной буквой, выразив одно обозначение из другого) и понимая, что сумма частот доминантного и рецессивного аллелей одного гена в популяции равна 1, мы получим первое уравнение:
1) p + q = 1
Откуда берется само уравнение Харди-Вайнберга? Вы помните, что при моногибридном скрещивании гетерозиготных организмов с генотипами Аа х Аа по второму закону Менделя в потомстве мы будем наблюдать появление разных генотипов в соотношении 1АА : 2 Аа : 1аа.
Поскольку частота встречаемости доминантного аллельного гена А у нас обозначена буквой р, а рецессивного аллеля а буквой q, тосумма частот встречаемости самих генотипов организмов (АА, 2Аа и аа), имеющих эти же аллельны гены А и а, будет тоже равна 1, то:
2) p²AA + 2pqAa + q²aa = 1

295. Аутосомы - парные хромосомы, одинаковые для мужских и женских организмов. В клетках тела человека 44 аутосомы (22 пары).
Половые хромосомы - хромосомы, содержащие гены, определяющие половые признаки организма.
В кариотипе (качественном и количественном наборе хромосом) женщин половые хромосомы одинаковые. В кариотипе мужчины - 1 одна крупная равноплечая половая хромосома, другая - маленькая палочковидная хромосома.
Половые хромосомы женщин обозначают XX, а мужские половые хромосомы - XY. Женский организм формирует гаметы с одинаковыми половыми хромосомами (гомогаметный организм), а мужской организм формирует гаметы неодинаковые по половым хромосомам (X и Y). Признаки, гены которых находится в половых хромосомах, называется сцепленные с полом. В у - хромосоме генов почти нет, поэтому если говорят, что признак сцеплен с полом, значит ген находится в х - хромосоме. Если ген расположен в у - хромосоме, то это обычно оговаривается. У человека известно около 300 генов, находящийся в х - хромосоме и вызывающих наследственные болезни. Почти все они рецессивны. Наиболее известны: гемофилия, дальтонизм, мускульная дистрофия. Если рецессивный ген болезни сцеплен с х - хромосомой, то носителем является женщина, а болеют мужчины, т.к. у них этот ген находится в одинарной дозе или гомозиготном состоянии. Доминантны х - сцепленных заболеваний известно мало, в том числе некоторые формы рахита, нарушение сегментации кожи.
Считается, что мутация в х - хромосоме чаще происходит в сперматогенезе, т.е. у отца и эту х-хромосому получит дочка. Наследование, сцепленное с у - хромосомой: в у - хромосоме находится около 35 генов, в том числе 7 вызывают болезни (гипертрикоз, нарушение сперматогенеза). Т.к. отец передает у - хромосому только сыну, такие болезни наследуются по мужской линии и называется голондрическими. У животных известно только х - сцепленное рецессивное наследование, в том числе гемофилия у собак, бесшерстность у телят, отсутствие зубов, деформация передних ног у телят, карликовость у кур. Х-хромосома у дрозофилы очень крупная и несет много генов, сцепленных с полом. Один из них относится к серии множественных аллелей, определяющих оттенки цвета глаз от темно-красного у мух дикого типа до совершенно белого. Аллель, определяющий белый цвет глаз, является последним в этой серии, т. е. он рецессивен по отношению ко всем остальным аллелям. Аллель дикого типа - первый в этой серии; он доминирует над всеми остальными аллелями.

296 Генети́чески модифици́рованный органи́зм (ГМО) — организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи методов генной инженерии. Это определение может применяться для растений, животных и микроорганизмов. Генетические изменения, как правило, производятся в научных или хозяйственных целях. Генетическая модификация отличается целенаправленным изменением генотипа организма в отличие от случайного, характерного для естественного и искусственного мутационного процесса.
Основным видом генетической модификации в настоящее время является использование трансгенов для создания трансгенных организмов.

Основные этапы создания ГМО:
1. Получение изолированного гена.
2. Введение гена в вектор для переноса в организм.
3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.
4. Преобразование клеток организма.
5. Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.
Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100—120 азотистых оснований (олигонуклеотиды).
Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: