Метод полимеразной цепной реакции. Применение в биологии и медицине.

В настоящее время большинство протоколов прямой ДНК-диагностики базируется на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаружить в пробе всего одну молекулу ДНК. Принцип метода основан на многократном увеличении числа копий искомого участка ДНК, достаточного для достоверной визуализации. Амплификацию (умножение) нуклеотидной последовательности ДНК катализирует ДНК-полимераза. Процесс репликации искомого фрагмента ДНК обуславливают генспецифические праймера – ДНК-олигонуклеотиды, каждый из которых комплементарен одной из двух цепей молекулы ДНК. Праймеры (20-30 нуклеотидных пар) служат затравками для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи ДНК. Длина амплифицируемого участка синтезируемой ДНК ограничена праймерами и обычно составляет несколько сот п.н. при этом каждая вновь синтезированная цепь ДНК (амплификон) служит матрицей для синтеза новой цепи комплементарной ДНК. Для получения достаточного количества копий искомого фрагмента ДНК требуется от 20 до 30 циклов ПЦР, характеризующихся экспоненциальным увеличением числа копий специфического фрагмента ДНК. Каждый цикл реакции включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах.

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Установление отцовства

Рис. 3: Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребёнок. (3) Мать. Ребёнок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Персонализированная медицина

Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства.^{[источник не указан 2005 дней]} Такой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping).

Клонирование генов

Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов и, в результатегенноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

Рис. 4: Клонирование гена с использованием плазмиды.
(1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В.

Секвенирование ДНК

В методе секвенирования с использованием меченных флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопомдидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченные флуоресцентной или радиоактивной меткой. Присоединение дидезоксинуклеотида к синтезируемой цепи приводит к обрыву синтеза, позволяя определить положение специфических нуклеотидов после разделения в геле.

Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

Этапы ПЦР

1 этап (денатурация). Нагревание ДНК до 95 С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2 этап (отжиг). Гибридизация праймеров при 55-60 С с комплементарными последовательностями на противоположных цепях ДНК (на левой и правой границах амплифицируемого фрагмента). Генспецифические праймеры создают при помощи компьютерных программ, использующих информацию о нуклеотидной последовательности известных генов микроорганизмов или генов человека, предоставленных на сайтах GenBank и EMBL

3 этап (элонгация). При температуре 68-72 С праймеры в присутствии ДНК-полимеразы и дезоксирибонуклеотидтрифосфатов служат затравками для синтеза комплементарной цепи на ДНК-матрице, начинающейся от места гибридизации праймера и происходящей в направлении 5’-3’. В последующих циклах вновь синтезируемые молекулы ДНК становятся, в свою очередь, матрицей для аналогичного синтеза новых копий. Поскольку синтез каждой из двух антипараллельных цепей ДНК начинается от места гибридизации праймера, эти места и становятся границами синтезируемого участка. По сути, метод ПЦР как бы «имитирует» на ограниченном участке гена естественный процесс репликации ДНК, происходящей in vito.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: