Сделай Сам Свою Работу на 5

Короткие тандемные повторы. Их роль в ДНК-диагностике

Результатом определения нуклеотидной последовательности человека стало картирование и описание всех основных геномных элементов: гены, псевдогены, повторы, транспозоны, ретротранспозоны.

Наряду с псевдогенами часто встречающимся элементом в геноме человека являются повторы. Насчитывается их около 5 миллионов, и покрывают собой почти половину генома. Повторы делятся на 2 основных класса: тандемные и диспергированные.

Тандемные повторы представляют собой повторяющиеся последовательности ДНК различной длины: микросателлиты содержат ДНК повторы от 1 до 6 нуклеотидов, минисателлиты от 7 до 100 нуклеотидов, сателлиты более 100 нуклеотидов.

 

 

Тандемные повторы или STR используются в КОСВЕННОЙ ДНК-ДИАГНОСТИКЕ (. Косвенные методы молекулярной диагностики пригодны для тех болезней, гены которых еще не идентифицированы и мутации неизвестны. Единственным и непременным условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрикции либо коротких минисателлитных тандемных повторов, типа STR (short tandem repeats), находящихся в непосредственной близости от мутантного гена или, что еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих полиморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена и проследить их передачу потомству.

*Секвенирование

Для установления точной нуклеотидной последовательности определенного фрагмента ДНК на практике наиболее широкое распространение получил метод секвенирования. Секвенирование (от лат. Sequentum — последовательность) — комплекс методов направленных на расшифровку аминокислотной или нуклеотидной последовательности биополимеров (белков и нуклеиновых кислот). Секвенирование ДНК — прочтение нуклеотидной последовательности первичной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты.

В основе реакции секвенирования лежит в принцип удлинения новосинтезированной цепи ДНК на изучаемой матрице (фрагмент ДНК, например, продукт ПЦР) при участии праймера, набора дезоксирибонуклеотид-трифосфатовиДНК-полимеразы.Помимо



природных трифосфатов в реакцию также добавляется один из 4 химически измененных дезоксирибонуклеотид-трифосфатов(терминаторов). В качестве таких терминаторов выступаютди-дезоксирибонуклеотид-трифосфаты(ddGTP, ddATP, ddTTP и ddCTP). Терминаторные буквы участвуют в реакциях секвенирования раздельно друг от друга при более низкой концентрации относительно их природных аналогов, таким образом, что в результате прохождения реакции они могут случайно встраиваться в растущую цепь обрывая её рост в различных местах по всей длине матрицы. При проведении четырех одинаковых реакции с разнымиди-дезоксирибонуклеотид-трифосфатамив каждой из пробирок накапливается набор дочерних молекул ДНК различной длины, оканчивающихся строго на один и тот же нуклеотид. После электрофореза продуктов этих реакций в 4 соседних дорожках проводится считывание информации от более коротких фрагментов к более длинным, при этом выявляемый пошаговый порядок удлинения цепей

иотражает последовательность нуклеотидов в составе анализируемойДНК-матрицы.При секвенировании геномной ДНК всегда следует помнить, что получаемая картина отражает нуклеотидную последовательность обоих аллелей изучаемого фрагмента гена. Поэтому в случае гетерозиготной мутации (например, нуклеотидной замены) в определенном месте авторадиограммы будут одновременно видны две полосы, соответствующие нормальному и мутантному основаниям. В случае гомозиготной мутации, а также в редких случаях секвенирования «однокопийной» ДНК (например, клонированной ДНК или фрагмента гена сХ-хромосомыу индивида мужского пола) мутация будет определяться как одна полоса, расположенная в атипичном сайте по отношению к нормальному сиквенсу.

Одномоментно может быть секвенирован участок ДНК средней длинной около 500 п.о., поэтому для исследования более длинных участков гена они должны быть амплифицированы в виде совокупности коротких перекрывающихся фрагментов, каждый из которых секвенируется отдельно. Обычно для обнаружения мутаций секвенируются только экзоны изучаемого гена вместе с примыкающими к ним интронными последовательностями (областями сплайсинга). Иногда при небольшом размере гена проводится секвенирование целой молекулы кДНК, получаемой при проведении обратнотранскриптазной ПЦР.

В настоящее время техника секвенирования ДНК значительно усовершенствовалась благодаря внедрению в практику лазерно-флюоресцентныхавтоматических секвенаторов

– специальных приборов, осуществляющих детекцию продуктов реакции в геле путем регистрации интенсивности их флюоресценции. Для этого реакция секвенирования проводится с использованием флуоресцентно-меченныхди-дезоксирибонуклеотид-трифосфатов. При дальнейшем проведении капиллярногогель-электрофореза,флуоресцентно-меченныемолекулы ДНК возбуждаются лазерным лучом и испускают сигнал определенной длиной волны, который фиксируется специальными датчиками и визуализируется на экране в виде разноцветных пиков. Для автоматического считывания

ианализа продуктов реакции используется соответствующее компьютерное программное обеспечение.

 

**К сведению: (Диспергированные повторы включают в себя транспозоны и ретротранспозоны. Транспозоны – это мобильные элементы, репликация которых включает перемещение своей ДНК последовательности на новое место в геноме. В геноме человека они занимают 2-3%,такие как MER1, MER2. Ретротранспозоны – это мобильные элементы, которые могут самовоспроизводиться в геноме, осуществляя реакцию обратной транскрипции. В геноме человека они занимают 42%, среди них такие семейства как Alu, MIR, LINE1, LINE2. )



©2015- 2018 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.