Колориметрические (фотометрические) методы

Азотометрические методы

Азотометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на определении количества белкового азота, образующегося при разрушении аминокислот, входящих в состав белков. Впервые метод был предложен Кьельдалем в 1883 году. В методе Кьельдаля, в настоящее время представляющем в целом исторический интерес, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до иона аммония и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, ион аммония может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения иона аммония в молекулярный азот под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы. Исходя из того, что белки из биологических объектов содержат в среднем 16 % азота, полученное в результате анализа количество азота умножают на коэффициент 6,25. Исторически используют фактор 6,25, хотя его величина зависит от белкового состава исследуемого образца. Для отдельных фракций белка в сыворотке или плазме величина фактора колеблется в диапазоне от 5,69 до 6,52.

( Метод Дюма, метод Кьельдаля)

Недостатком азотометрических методов является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в ряде случаев в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости.

Преципитационные» методы

«Преципитационные» методы определения общего белка основаны на снижении растворимости белков и образовании суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния (нефелометрический метод анализа), определяемого числом светорассеивающих частиц, либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Результаты данной группы методов зависят от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих индивидуальных белков с использованием специфических антител.

Колориметрические (фотометрические) методы

Колориметрические методы определения общего белка основаны на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя.

Среди колориметрических методов определения концентрации общего белка сыворотки наиболее распространенным считается биуретовый метод, основанный на так называемой «цветной биуретовой реакции», в ходе которой белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет, интенсивность окраски зависит от концентрации общего белка в сыворотке

Колориметрические методы определения общего белка достаточно просты и относительно дешевы. К недостатку метода относится интерферирующее действие некоторых веществ (в том числе лекарств).

Наиболее распространённым количественными методами являются метод Кьельдаля, Лоури с реактивом Фолина, Войвуда в модификации Т.А. Глагоревой, К.А. Мерка.

1) Б и у р е т о в ы й м е т о д- по пептидным связям белковой молекулы;

Принцип метода. Метод основан на способности белков давать с раствором сернокислой меди фиолетовое окрашивание в щелочной среде. Для биуретовой реакции необходимо наличие двух ОН-групп и трех атомов азота, находящихся в полипептидной цепи. Группа, образующая пептидную связь (– ОС – NH –) в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной форме. В избытке щелочи происходит диссоциация водорода енольной ОН-группы, при этом возникает отрицательный заряд, с помощью которого кислород, взаимодействуя с медью, образует соль; кроме того, медь образует дополнительные (дативные) связи с атомами азота пептидных связей. Возникший комплекс характеризуется высокой стабильностью.

Чувствительность данного метода позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 2 до 10 мг в пробе.

Реактивы: 1. Раствор сывороточного альбумина, содержащий 10 мг белка в 1 мл (стандартный раствор).

2. Биуретовый реактив: 0,15 г СuSО4∙5Н2О и 0,6 г натрий-калия виннокислого (NаКС4Н4О6•4Н2О) растворяют в 50 мл Н2О, при энергичном перемешивании приливают 30 мл 10 % раствора NаОН, затем добавляют 0,1 г КI. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл. Реактив хранят в парафинированной или полиэтиленовой склянке в течение 1 мес. Ход работы. Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 2, 4, 6, 8 и 10 мг альбумина в 1 мл. В каждую пробирку, содержащую 1 мл раствора белка соответствующего разведения добавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность раствора на ФЭК при 540 нм в 1 см кювете.

На каждую точку проводят два определения, для построения калибровочного графика используют среднее арифметическое.

Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------

Б и у р е т о в ы й м е т о д.Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков.

Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.

Комплексной медно-натриевой соли пептидов приписывают следующее строение:

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

#4

Sinnerman

Биуретовая реакция на белок

Принцип метода

Пептидные связи белка с солями меди в щелочной с образуют комплекс фиолетового цвета. Белки предварительно осаждают трихлоруксусной кислотой.

Необходимые реактивы

I. 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

II. 20%-ный раствор меди (CuSO4∙5H2O).

III. 3%-ный раствор NaOH.

М е т о д Л о у р и. Метод количественного определения белка, основанный на измерении концентрации окрашенных продуктов, образующихся в результате сочетания двух химических реакций: биуретовой реакции на пептидную связь и взаимодействия реактива Фолина-Чокалтеу с ароматическими аминокислотами.

Фолина — Чокалтеу реактив смесь растворов вольфрамовокислого и молибденовокислого натрия, к которой добавляют последовательно фосфорную, соляную кислоту и, после кипячения, сульфат лития, а также несколько капель бромной воды;

Метод Лоури

Метод Лоури объединяет биуретовый реагент с другим (реагент Фолина), последний реагирует с остатками тирозина и триптофа в белках. Это дает синеватый цвет, который поглощает в область между 500 - 750 нм в зависимости от того, какая требуется чувствительность. Существует небольшой пик поглощения около 500 нм, который может быть использован для определения высоких концентраций белка и интенсивный пик около 750 нм, который может быть использован для определения низких концентраций белка. Этот метод является более чувствительной к низкому содержанию белков, чем просто метод с биуретовым реактивом.

Принцип В щелочной среде ионы Cu+2 образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu+. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм. Увеличение адсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка. Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах), чувствительность к белку — 10 — 100 мкг/мл.

(Синие окрашивание.)

По аминокислотным радикалам.--- нингидриновая, ксантопротеиновая, реакции Миллона, Адамкевича, , Фоля).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: