Качественное обнаружение активности пероксидазы и каталазы в слюне.

Теория вопроса. Каталаза (КФ 1.1.11.6) и пероксидаза (КФ1.1.11.7) отно­сятся к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Ферменты каталаза и пероксидаза являют­ся антиоксидантами, так как обеспечивают прямое обезвреживание кислорода. Ферменты каталаза и пероксидаза принимают участие во всех биохимических процессах, поддерживая нормальный уровень обмена перекиси водорода, которая из-за своей токсичности не должна накапливаться в клетках. Каталаза и пероксидаза избирательно катализируют разрушение перекиси водорода, восстанавливая ее до двух молекул воды. К пероксидазам относятся ферменты, катализирующие окисление субстрата с помощью перекиси водорода.

_{пероксидаза}

Н₂О₂+АН₂ 2Н₂О+А

Слюнная пероксидаза (СПО) катализирует окисление тиоционатов путем расщепления перекиси водорода с образованием гипотиоционатов, которые оказывают антимикробное действие. Образовавшийся гипотиоционат оказывает в 10 раз более мощное антибактериальное действие, чем Н₂О₂. При спонтанном распаде Н₂О₂ образует реакционные формы кислорода: гидроксидный радикал супероксидный анионрадикал. Эти реакционные формы кислорода и гипотиоционат совместно воздействуют на ненасыщенные жирные кислоты, белки, нуклеиновые кислоты, что приводит к образованию продуктов свободно-радикального окисления, нарушению структур клеток и их гибели.

Таким образом, биологическая роль СПО в полости рта заключается в том, что с одной стороны продукты окисления тиоционатов ингибируют рост и метаболизм лактобацилл и некоторых других микроорганизмов, а с другой стороны предотвращают аккумуляцию Н₂О₂ многими видами стрептококков полости рта.

Под влиянием пероксидазы могут окисляться фенолы, полифенолы, в том числе бензидин. От субстратов под действием пероксидазы переносятся электроны на перекись водорода. Образуются окисленный субстрат и вода. Пероксидазы относятся к геминовым ферментам: в состав их простетической группы входит гем. Пероксидаза содержится почти во всех растительных и животных клетках. В организме человека и животных гемоглобин, миоглобин и цитохромы обладают слабой пероксидазной активностью. Об этой активности можно судить по изменению окраски бензидина. Окисленный бензидин приобретает зеленую окраску, постепенно переходящую в бурую.

Ход работы: В одну пробирку наливают 5 капель 1% раствора бензидина, 4-5 капель 3% раствора перекиси водорода, затем добавляют 5 капель слюны. Наблюдают изменение окраски. Окисленный бензидин приобретает зеленую окраску, переходящую в бурую.

Определение активности каталазы в слюне.

Теория вопроса. Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду. По химической природе каталаза является геминоферментом, так как в состав простетической группы этого фермента входит гем.

2Н₂О₂ ^{каталаза} 2О₂ + 2Н₂О

Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях, но особенно много ее в строме эритроцитов и печени. Биологическая роль каталазы заключается в разложении перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. Перекись водорода может образовываться в организме во время течения окислительно-восстановительных процессов.

Определение активности каталазы и пероксидазы имеет важное значение для диагностики заболеваний. Снижение активности этих ферментов в крови и слюне наблюдается у больных, страдающих вирусным гепатитом, злокачественными новообразованиями, анемией, туберкулезом.

Ход работы: В пробирку наливают 10-15 капель 1%-ного раствора перекиси водорода и добавляют 1мл слюны. Жидкость вспенивается, так как происходит бурное выделение молекул кислорода.

Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

Теория вопроса. Амилаза слюны относится к классу гидролаз, расщепляет α-1,4-гликозидные связи в молекулах крахмала и гликогена. Продуктами расщеп­ления названных полисахаридов являются декстрины и небольшое количество мальтозы, глюкозы. Исследование химической структуры амилазы слюны показало её идентичность структуре амилазы панкреатического происхождения. Хлориды, йодиды, цианиды повышают активность амилазы слюны, при этом наибольшим активирующим эффектом обладают ионы хлора. Ингибиторами могут быть неорганические соли, различные метаболиты. Изучение влияния на активность ферментов различных веществ имеет большое практическое значение, а также очень важно для понимания механизма действия ферментов.

Ход работы: 1. В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, во вторую - 8 капель воды и 2 капли 1% раствора хлорида натрия, а в третью - 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди (II).

В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной (1:10) слюны, содержимое пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 минут.

Тем временем, готовят три пробирки с водой (по 1 мл в каждой), подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 2-3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В первой пробирке появляется фиолетовая или красно-бурая окраска, во второй пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в третьей пробирке, где ионы меди тормозят действие амилазы, окраска синяя.

Влияние физических нагрузок на активную реакцию слюны.

Теория вопроса. Одним из главных естественных регуляторов биохимических процессов в полости рта является рН среды. При выполнении физических нагрузок, заболеваниях, сопровождающихся недостаточным обеспечением организма кислородом, интенсивно протекают процессы гликолиза. Нагрузки высокой интенсивности способствуют активации гликолиза, а следовательно, и резкому повышению уровня молочной кислоты в крови, что приводит к уменьшению щелочного резерва крови. Однако в связи с тем, что буферность крови достаточно велика, существенных изменений рН крови обычно не происходит; ацидоз остается компенсированным. Иное наблюдается в биологических жидкостях (моча, слюна), обладающих меньшей буферностью, чем кровь: величина рН в них несколько уменьшается. Таким образом, изменение кислотности мочи и слюны может также характеризировать реакцию организма на физические нагрузки, отражая в известной степени процессы, происходящие в работающих мышцах и в крови. Считается, что снижение рН слюны является также прогностическим симптомом кариеса зубов.

Ход работы. Двум или четырем испытуемым предлагают тщательно прополоскать рот. Каждому из них дают 20 мл дистиллированной воды, (надо тщательно размешать ее языком в течение трех минут). Полученные пробы выливают в стаканчик с цифрой № 1 (покой). Второй группе, из двух или четырех испытуемых, предлагают бежать на месте максимально возможным темпом в течение 1 минуты. По окончанию бега собрать пробы слюны в стаканчик с цифрой №2.

В обеих пробах определяют рН слюны с помощью универсального индикатора. Для этого смачивают полоску индикаторной бумаги испытуемой слюной. Сравнивают эту полоску со стандартом. На предлагаемой индикаторной шкале определяем рН с точностью до 0,5 рН.

Определение молочной кислоты в слюне.

Теория вопроса. Органическими компонентами ротовой жидкости являются протеины, углеводы, свободные аминокислоты, ферменты, витамины С, Р и группы В, а также многие другие вещества. Органические вещества поступают в слюну из сыворотки крови (аминокислоты, мочевина) выделяются слюнными железами (муцин, амилаза, гликопротеины, иммуноглобулины класса. А и другие), а также выделяются микроорганизмами.

Особенности органического состава слюны состоят в постоянном дефиците основных энергетических субстратов: углеводов, белков, липидов и потому при наличии высокоактивных ферментных систем микробного, лейкоцитарного и железистого происхождения, происходит их быстрая утилизация. Так, употребление пищи, богатой углеводами, может вызвать своеобразный «метаболический взрыв» в полости рта. Он проявляется активацией ферментов углеводного обмена, усиленным расщеплением глюкозы до органической молочной кислоты.

Ход работы. Реакция Уффельмана. Принцип метода. Молочная кислота в присутствии фенолята железа (реактив Уффельмана), окрашенного в фиолетовый цвет, образует лактат железа желто-зеленого цвета:

2) (C₆H₅O₃)3Fe + 3СНзСНОНСООН →

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: