ГЛАВА 8. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ МИКРОБИАЛЬНОГО СИНТЕЗА

Продуктами биотехнологических производств являются природные макромолекулы – белки, ферменты, полисахариды, полиэфиры (поли-β-гидроксибутират), выделенные из клеток микроорганизмов, тканей и органов растений и животных.

По отношению к процессу роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные метаболиты (рис. 8.1). Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. К ним относятся структурные единицы биополимеров – аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, а также витамины, коферменты, органические кислоты и другие соединения. Вторичные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины) – низкомолекулярные соединения, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста.

Рис. 8.1. Динамика изменения биомассы и образования первичных (А)

и вторичных (Б) метаболитов в процессе роста организма: 1 – биомасса; 2 – продукт

Биотехнология получения первичных метаболитов

Многие первичные метаболиты представляют значительную ценность. Первичные метаболиты синтезируются природными микроорганизмами в количествах, необходимых лишь для удовлетворения их потребностей. Поэтому задача промышленных микробиологов состоит в создании мутантных форм микроорганизмов – сверхпродуцентов соответствующих веществ. В этой области достигнуты значительные успехи: например, удалось получить микроорганизмы, которые синтезируют аминокислоты вплоть до концентрации 100 г/л (для сравнения – организмы дикого типа накапливают аминокислоты в количествах, исчисляемых миллиграммами).

Производство аминокислот

Среди соединений, получаемых биотехнологическими методами, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот составляет более 500 тыс. т в год. Однако указанный объем – лишь небольшая доля от требуемого количества аминокислот. По данным ВОЗ, потребность человечества всего лишь в четырех незаменимых аминокислотах составляет, млн т: для лизина – 5, метионина – 4, треонина – 3,7 и триптофана – 2.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

· гидролизом природного белоксодержащего сырья;

· химическим синтезом;

· микробиологическим синтезом;

· биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

Гидролиз природного белоксодержащего сырья. При гидролизе белоксодержащее сырье (отходы пищевой и молочной промышленности) нагревают с растворами кислот или щелочей при температуре 100 – 105 °С в течение 20 – 48 ч. Чаще всего используют 20 %-й раствор соляной кислоты, обеспечивающий глубокий гидролиз белка. В ходе кислотного гидролиза белков происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их аминокислот. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10 – 30 %). Кроме того, для ускорения реакции гидролиза белков используют иммобилизованные протеолитические ферменты и ионообменные смолы. Аминокислоты, полученные методом гидролиза, используют, в медицине, животноводстве, пищевой и микробиологической промышленности.

Химический синтез.Используя метод химического синтеза аминокислот целевой продукт получают в виде рацемической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее большинство природных аминокислот относится к L-ряду. D-α-аминокислоты обнаружены лишь в составе гликопротеинов клеточных стенок бактерий, антибиотиков и некоторых токсинов. Проницаемость L-аминокислот в клетке в 500 раз превышает таковую ее антипода. Стереоспецифичны также транспорт и метаболизм аминокислот. Разделение рацематов других аминокислот – дорогая и чрезвычайно трудоемкая процедура.

Исключением в этом отношении является лишь метионин, метаболизм которого нестереоизбирателен, благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем химического синтеза, что экономически более выгодно в сравнении с микробиологическим способом.

Микробиологический синтез. Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот. Более 60 % всех производимых в настоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главное преимущество которого в сравнении с методами химического синтеза состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.

Большинство диких штаммов микроорганизмов способны продуцировать аминокислоты во внешнюю среду в очень незначительных количествах. Среди возможных продуцентов глутаминовой кислоты отмечены организмы, из которых 30 % – дрожжи, 30 % – стрептомицеты, 20 % – бактерии и 10 % – микроскопические грибы.

Перспективные штаммы продуцентов постоянно улучшают посредством селекции мутантов с измененной генетической программой и регуляторными свойствами. Распространенные объекты селекции продуцентов – микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Arthrobacter (табл. 8.1).

Таблица 8.1.

Микроорганизмы – продуценты аминокислот

Разработка технологической схемы получения отдельной аминокислоты базируется на знании путей и механизмов регуляции биосинтеза конкретной аминокислоты. Необходимого дисбаланса метаболизма, обеспечивающего сверхсинтез целевого продукта, добиваются путем строго контролируемых изменений состава и условий среды.

Производство лизина.Метаболический путь и характеристика продуцентов.В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного метаболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот – лизина, метионина и треонина (рис.8.2). В процессе образования аминокислот из общего предшественника одновременно с лизином возникают две другие аминокислоты – метионин и треонин. В этом случае эффекта накопления в среде всего одной целевой аминокислоты добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных аминокислот, возникающих в связи с разветвлением метаболического пути.

	Фермент аспартаткиназа, открывающий метаболический путь, является аллостерическим белком, чувствительным к ингибированию по принципу обратной связи при совместном и согласованном действии побочных продуктов L-треонина и L- лизина.
Рис.8.2. Схема биосинтеза лизина, метионина и треонина в клетках Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum

При накоплении треонина и лизина в избыточной концентрации инги-бируется аспартаткиназа и их синтез останавливается, при пониженной концентрации любой из двух аминокислот процесс активизируется.

Чтобы добиться о бразования лизина в больших количествах, получают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезируется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результате чего блокируется синтез метионина и треонина. Такие мутанты являются ауксотрофами по гомосерину или треонину (метионину); внутриклеточная концентрация треонина у них существенно снижена, что снимает блокаду с аспартаткиназы.

Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминирующему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувствительность к концентрациям аллостерического ингибитора – лизина.

Технология получения. В качестве источников углерода для культивирования продуцентов лизина используют вторичное сырье: свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. Источниками азота являются мочевина и соли аммония. Кроме того, в питательную среду добавляют необходимые для жизнедеятельности макро- и микроэлементы (Р, Са, Mg, Mn, Fe и др.); стимуляторы роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрожжей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, витамины группы В. Степень аэрации индивидуальна для производства каждого конкретной продуцента.

Лизин появляется в культуральной среде начиная с середины экспоненциальной фазы роста культуры и достигает максимума к ее концу. Поэтому на первой стадии технологического процесса формируют биомассу продуцента, которую выращивают в специальных посевных аппаратах в течение суток (рН 7,0 – 7,2; температура 28 – 30 °С), а затем подают в производственный ферментер, заполненный питательной средой. Лизин начинает поступать в культуральную жидкость через 25 – 30 ч после начала ферментации. Важный фактор, обеспечивающий в культуральной среде высокие концентрации аминокислоты, синтезированной внутри клетки, – проницаемость клеточных мембран. Проницаемость клеточной мембраны увеличивают либо с помощью мутаций, либо путем изменения состава питательной среды. В последнем случае в культуральной среде создают дефицит биотина (1 – 5 мкл/л), добавляют пенициллин (2 – 4 мкг/л), детергенты (твин-40 и твин-60) или производные высших жирных кислот (пальмитаты, стеараты). Биотин контролирует содержание в клеточной мембране фосфолипидов, а пенициллин нарушает биосинтез клеточных стенок бактерий, что повышает выделение аминокислот в среду.

По завершении процесса ферментации (через 55 – 72 ч) жидкую фазу отделяют от культуры клеток микроорганизма фильтрованием и используют для выделения из нее лизина.

Высокоочищенные препараты лизина получают после фракционирования фильтрата культуральной жидкости методом ионообменной хроматографии на катионите. С этой целью лизин переводят в форму катиона:

H₃N—СН—СООН

(СН₂)₄

NH₃

Для данного процесса фильтрат обрабатывают соляной кислотой до рН 1,6 – 2,0. Обладая двумя положительно заряженными ионогенными группировками, лизин прочно сорбируется на смоле и элюируется с нее в виде индивидуального соединения 0,5 – 5 %-м раствором гидроксида аммония после выхода всех других катионов. Элюат концентрируют в вакууме при температуре 60 ^оС, переводят в форму монохлоргидрата, после чего высушивают и дополнительно чистят с помощью перекристаллизации. В результате получают препараты кристаллического лизина 97 – 98 %-й чистоты, которые используют для повышения питательной ценности пищевых продуктов и в медицинской промышленности.

Кроме высокоочищенных препаратов лизина получают иные виды его товарной формы: жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кормовой концентрат лизина (ККЛ) и высококонцентрированные кормовые препараты, характеризующиеся относительно меньшей степенью очистки в сравнении с первым препаратом.

Производство триптофана. Метаболический путь и характеристика продуцентов. Подобно лизину триптофан образуется в ходе разветвленного метаболического пути (рис.8.3).

Рис.8.3. Метаболический путь синтеза триптофана

Однако при использовании ауксотрофных мутантов, у которых блокированы реакции, ведущие к синтезу фенилаланина и тирозина в среде, избыточное накопление триптофана в среде не наблюдается, что объясняется особенностью регуляции биосинтеза триптофана у микроорганизмов. Метаболическим предшественником триптофана служит антраниловая кислота, которая возникает из хоризмовой кислоты под действием антранилатсинтетазы. Триптофан оказывает ингибирующее действие на антранилатсинтетазу, поэтому для обхода метаболического контроля синтез фермента индуцируют ступенчатым введением предшественника – антраниловой кислоты.

В связи с этой особенностью промышленное производство триптофана организовано преимущественно по двухступенчатой схеме.

Технология получения. На первом этапе химическим способом синтезируют антраниловую кислоту, которую с помощью энзиматической системы мутантных штаммов дрожжей Candida utilis переводят в триптофан.

Биомассу дрожжей выращивают при температуре 30 °С в среде, содержащей свекловичную мелассу, мочевину и минеральные компоненты. Через сутки в ферментер вводят 5 %-й спиртовой раствор антраниловой кислоты и 50 %-й раствор мочевины, а через 3 – 4 ч после введения предшественника дополнительно добавляют источник углерода (25 %-й раствор мелассы). Антраниловую кислоту и мочевину подают через каждые 6 ч, а мелассу – через каждые 12 ч. Процесс двухступенчатой ферментации завершается через 144 ч и обеспечивает содержание триптофана в культуральной среде до 6 г/л.

После сушки культуральной жидкости получают кормовой концентрат триптофана (ККТ), который включает белки, свободный триптофан, витамины В₁ В₂ и PP. Высокоочищенные кристаллические препараты триптофана образуются после дополнительной очистки культуральной жидкости методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной катионитом (сорбция при рН 1,0; элюция 5%-м раствором гидроксида аммония в смеси с пропанолом-2). Элюаты кристаллизуют; кристаллы отмывают и высушивают. Кристаллический препарат содержит до 99 % триптофана.

Кроме триптофана микробиологическим способом с использованием предшественников получают гистидин, изолейцин, метионин, серии и треонин.

Химико-микробиологический метод. В последние годы при производстве аминокислот все шире используют биотрансформацию предшественников аминокислот, с помощью иммобилизованных ферментов или клеток микроорганизмов, предварительно получаемых химическим путем.

Применение ферментов в производстве аминокислот обеспечивает стереоспецифичность процессов их синтеза, что выгодно отличает биотехнологические производства от химических.

Получение L-лизина.Процесс получения лизина основан на стереоспецифическом ферментативном гидролизе (конверсии) D-,L-α-амино-ε-капролактама, который сначала получают химическим путем из циклогексена:

Рацемат используют в качестве субстрата, который под действием фермента L- α-амино-ε-капролактамгидролазы (лактамаза) превращается в L-лизин, а оставшаяся непрореагировавшая его часть (D-форма) переводится при воздействии рацемазы в смесь антиподов:

Лактамаза найдена у некоторых видов дрожжей и бактерий, в частности у Candida laurentii. При производстве лизина в водный раствор D-,L-α-амино-ε-капролактама одновременно вводят источники лактамазы и рацемазы, содержащиеся в дрожжевых и бактериальных клетках. Процесс осуществляется при температуре 30 – 50 °С, рН 8,0 – 8,5 и оптимальном режиме аэрации. На выходе из реактора образуется преимущественно один продукт – лизин, который выделяют из смеси, очищают и сушат. Описанная технология получения лизина обеспечивает содержание аминокислоты в реакционной среде свыше 150 г/л. Кроме того, созданы мутанты, у которых целевой продукт – лизин далее не вовлекается в обмен веществ, что увеличивает выход искомого продукта.

Получение триптофана. Химико-ферментативный способ получения триптофана состоит в прямой конденсации индола, аммиака и пировиноградной кислоты:

Реакцию катализирует пиридоксальзависимая триптофаназа. Фермент найден у бактерий Е. coli, Bacillus albei, Proteus rettgeri и характеризуется широкой субстратной специфичностью. Добавление триптофана индуцирует образование фермента, а добавление индола ингибирует его синтез у бактерий, поэтому процесс получения триптофана ведут при избытке аммиака и пирувата. Выход аминокислоты при реализации химико-энзиматического способа получения триптофана составляет 63 г/л.

Перечень целевых аминокислот, производимых химико-ферментативным способом разнообразен (L-аспарагиновая кислота, L-аланин, L-глутамин, L-лизин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистеин, L-фенилаланин, L-метионин). Химико-энзиматический способ в сравнении с микробиологическим более специфичен, не требует процедуры очистки аминокислот от побочных продуктов и сточных потоков. Однако по стоимости сырья и ферментативных препаратов он еще уступает микробиологическому способу.

Применение аминокислот. Помимо применения в качестве пищевых добавок, приправ и усилителей вкуса аминокислоты используют как сырье в химической, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве ряда других веществ:

Производство витаминов

Витамины (от лат vita – жизнь) – «амины жизни» – низкомолекулярные органические соединения, которые, присутствуя в малых количествах, обеспечивают нормальное протекание биохимических процессов. Витамины – незаменимые факторы питания.

Изучение физиологии и генетики микроорганизмов – продуцентов витаминов, выяснение путей биосинтеза каждого из них позволили создать теоретические основы получения микробиологическим способом практически всех известных витаминов. Однако биотехнологическими методами целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В₂, В₁₂, β-каротин и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.

Получение витамина В₂ (рибофлавин). Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени – 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина – гриб Eremothecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В₂. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В₂, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В₂ – розеофлавину.

Технология получения. В состав среды для роста продуцентов витамина В₂ входят соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфицированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стерилизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики.

В качестве посевного материала используют споры Е. ashbyii. Процесс ферментации грибов для получения кормового рибофлавина длится 3 суток при температуре 28 – 30 °С. Концентрация рибофлавина в культуральной жидкости может достигать 1,4 мг/мл. По завершении процесса ферментации культуральную жидкость концентрируют в вакууме, высушивают на распылительной сушилке (влажность 5 – 10 %) и смешивают с наполнителями.

Методами генной инженерии сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризующийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез рибофлавина и способный синтезировать втрое больше по сравнению с Е. ashbyii количество рибофлавина за 40 ч ферментации.

Получение витамина В₁₂. Витамин В₁₂ открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. Первоначально витамин В₁₂ получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. В 1972 г. в Гарвардском университете был осуществлен химический синтез предшественника витамина В₁₂. Химический синтез корнестерона – структурного элемента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса. Учитывая важную функцию витамина в организме человека (он является противоанемическим фактором), его мировое производство достигло 10 т в год, из которых 6,5 т расходуют на медицинские нужды, а 3,5 т – в животноводстве.

Единственный способ получения витамина В₁₂ в настоящее время – микробиологический синтез. Его продуцентами являются прокариоты и, прежде всего, пропионовые бактерии, которые и в естественных условиях образуют этот витамин. Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12. Мутанты Propionibacterium shermanii и Pseudomonas denitrificans продуцируют в жидкой среде до 58 – 59 мг/л цианкобаламина.

Технология получения. Для получения высокоочищенных препаратов витамина В₁₂ пропионовокислые бактерии культивируют периодическим способом без доступа кислорода на средах, содержащих глюкозу, казеиновый гидролизат, витамины, неорганические соли, хлорид кобальта. Уровень рН ферментационной среды поддерживают около 7,0 добавлением NH₄OH; продолжительность ферментации 6 суток; через 3 суток в среду добавляют 5,6-диметилбензимидазол. Добавление в среду предшественника 5,6-диметилбензимидазола по окончании первой ростовой фазы (5 – 6 суток) стимулирует быстрый (18 – 24 ч) синтез витамина с выходом последнего до 30 мг/л.

Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4,5 – 5,0 и температуре 85 – 90 ^оС, в присутствии стабилизатора (0,25 % раствор натрия нитрита), Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натрия, добавляют коагулянты белка – хлорид железа трехвалентного и алюминия сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3 – 4 ^оС из в одноацетонового раствора.

При реализации данного биотехнологического процесса не забывать о высокой светочувствительности витамина В₁₂, поэтому все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или при красном свете).

Получение β-каротина. β-Каротин – это изопреноидные соединения, из одной молекулы β-каротина при гидролизе образуются две молекулы витамина A. Каротиноиды можно выделить из ряда растительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны, а также они синтезируются многими пигментными микроорганизмами из родов Aleuria, Blakeslea, Corynebacterium, Flexibacter, Fusarium, Halobacterium, Phycomyces, Pseudomonas, Rhodotorula, Sarcina, Sporobolomyces и др. Характерно, что содержание β-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora – 3 – 8 тыс. мкг.

Каротиноиды локализуются в виде сложных эфиров и гликозидов в клеточной мембране микроорганизмов, либо в гранулах цитоплазмы.

Технология получения. Питательные среды для производства β-каротина включают источники углерода, азота, витаминов, микроэлементов, специальных стимуляторов (кукурузно-соевая мука, растительные масла, керосин, -ионон или изопреновые димеры). В качестве продуцентов каротиноидов можно использовать бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Более часто применяют зигомицеты Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. При совместном культивировании штаммы этих видов могут образовать 3 – 4 г каротина на 1 л среды. Па первом этапе получения каротиноидов штаммы культивируют раздельно, а затем – совместно при 26 ^оС и усиленной аэрации с последующим переносом в основной ферментатор. Длительность ферментации – 6 – 7 дней. Каротиноиды извлекают ацетоном или другим неполярным растворителем. В целях очистки и более тонкого разделения используют методы хроматографии. Витамин A из β-каротина сравнительно легко можно получить при гидролизе.

Получение витамина D₂. Витамин D – это группа родственных соединений, в основе которых находится эргостерин, который обнаружен в клеточных мембранах эукариот. Содержание эргостерина в дрожжевых клетках колеблется в пределах 0,2 – 11 %. Кроме дрожжей продуцентами эрогостерина могут быть мицелиальные грибы – аспергиллы и пенициллы, в которых содержится 1,2 – 2,2 % эргостерина. Трансформация эргостерина в витамин D₂ (кальциферол) происходит под влиянием ультрафиолетового облучения. При этом разрывается связь в кольце (позиции 9,10) и образуется двойная связь в боковой цепочке (позиции 22, 23).

Технология получения. В качестве продуцентов эргостерина микробиологическим способом используют культуры дрожжей, которые получают на средах, обеспечивающих полноценное развитие клеток. Основная среда содержит источник углерода и пониженное количество азота (высокое значение C/N), обогащается ацетатом (активатором биосинтеза стеринов). Культивирование дрожжей проводят при температуре, близкой к оптимальной для конкретного штамма, и выраженной аэрации. Спустя 3 – 4 суток, в зависимости от ростовых характеристик и биосинтетической активности культуры, клетки сепарируют и подвергают вакуум-высушиванию. Затем сухие дрожжи облучают ультрафиолетовыми лучами – УФЛ (длина волны 280 – 300 нм) в течение оптимального по продолжительности времени. Облучение дрожжей можно проводить до сепарирования клеток в тонком слое 5 % суспензии, учитывая малую проникающую способность УФЛ.

Облученные сухие дрожжи применяют в животноводстве; в промышленности их выпускают под названием «кормовые гидролизные дрожжи, обогащенные витамином D₂». В таком препарате содержится не менее 46 % сырого белка, незаменимые аминокислоты (лизин, метионин, триптофан) и 5000 ME витамина D₂ в 1 г.

В случае получения кристаллического витамина D₂ клетки продуцента гидролизуют соляной кислотой при 110 ^оС, затем температуру снижают до 75 – 78 ^оС и добавляют этанол. Спиртовой экстракт упаривают до 70 %-го содержания сухих веществ. Полученный «липидный концентрат» обрабатывают раствором едкого натрия. Эргостерин кристаллизуется из неомыленнной фракции концентрата при 0 ^оС. Его очищают повторной перекристаллизацией. Кристаллы высушивают, растворяют в серном эфире, облучают УФЛ, эфир отгоняют, раствор витамина D₂ концентрируют и кристаллизуют.

8.1.3. Производствоорганических кислот

Получение лимонной кислоты. Лимонная кислота впервые была выделена из сока лимона и перекристаллизована Шееле. В лимонах содержится 7 – 9 % этой кислоты; в Италии и Испании до сих пор ее получают из лимонов, но на 99 % ее продукция основана на микробиологическом синтезе. Объем мирового производства цитрата составляет 400 тыс. т/год.

Большая часть лимонной кислоты (70 %) используется в пищевой промышленности, около 12 % в фармацевтической промышленности и около 18 % – для технических целей. Использование лимонной кислоты в пищевой промышленности обусловлено ее хорошей растворимостью, низкой токсичностью и приятным кислым вкусом. Лимонная кислота образует хелаты с металлами, поэтому ее применяют для их очистки.

Способность грибов образовывать лимонную кислоту при росте на средах с углеводами впервые была установлена немецким ученым Вемером в 1893 г. Для промышленного производства лимонной кислоты используют главным образом культуру гриба Aspergillus niger, а также A. wentii.

Метаболический путь. Лимонная кислота – обычный метаболит цикла трикарбоновых кислот, в небольшом количестве присутствует в клетках разных микроорганизмов. Некоторые грибы (в первую очередь A. niger) способны синтезировать огромное количество этой кислоты. Накопление в культуральной среде существенных количеств цитрата – промежуточного соединения цикла Кребса – невыгодно для организма и является следствием дисбаланса метаболизма или нарушения его генетической природы. Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста грибов-продуцентов минеральными компонентами среды и одновременном избыточном содержании источника углерода. В условиях лимитирования роста гриба недостатком одного или нескольких минеральных компонентов (Fe, Mn, N, Р или S) после полного поглощения из среды дефицитного элемента он прекращает расти, однако продолжает потреблять имеющийся в среде источник углерода. При этом в клетках гриба начинает накапливаться лимонная кислота, которая в дальнейшем выделяется в среду.

Технология получения. В настоящее время получение лимонной кислоты биотехнологическими способами широко применяется в промышленности. Разработаны технологии получения лимонной кислоты как поверхностным, так и глубинным способами. Основной питательной средой в обоих случаях служит меласса – отход сахарного производства, она содержит 48 – 50 % сахара. Для хорошего роста и развития гриба среда должна содержать минеральные соли: NH₄Cl, KH₂PO₄, ZnSO₄. В мелассе содержатся соли тяжелых металлов, угнетающие рост гриба и образование лимонной кислоты. Для осаждения этих солей к мелассе добавляют желтую кровяную соль K₄[Fe(CN)₆].

Процесс ферментации, ведущий к образованию лимонной кислоты, проводят при низких значениях рН (3 – 4), что облегчает поддержание стерильных условий ферментации и уменьшает возможность образования побочных продуктов. Предполагают, что в кислой среде стимулируется гликолиз, что обеспечивает направление потока углерода в цикл Кребса. В щелочной среде происходит накопление щавелевой и глюконовой кислот. В процессе ферментации можно выделить две фазы: 1) активного роста гриба и 2) интенсивного кислотообразования, рост мицелия в этот период становится незначительным.

На первой стадии идет рост мицелия, а на второй, после выхода культуры в стационарную фазу – интенсивный синтез лимонной кислоты. В конце ферментации массу мицелия отделяют путем фильтрования и промывают. Затем при рН < 3,0 в виде кальциевой соли осаждают щавелевую кислоту, а из маточного раствора выделяют лимонную кислоту в форме средней соли, кристаллизующейся в комплексе с четырьмя молекулами воды. Свободную кислоту выделяют из промытых кристаллов соли после их обработки сульфатом кальция. Высокоочищенные препараты лимонной кислоты получают после дополнительной процедуры очистки методом ионообменной хроматографии. Выход продукта составляет 85 %.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: