Иммобилизованные ферменты

Одна из задач инженерной энзимологии состоит в разработке технологии получения и использования иммобилизованных ферментов. Иммобилизованными ферментами называются ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства. Начало этому направлению биотехнологии было положено в 1916 году, когда Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность.

Носители для иммобилизации ферментов. К носителям предъявляются следующие требования:

· высокая химическая и биологическая стойкость;

· высокая химическая прочность;

· достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность;

· возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран);

· легкая активация;

· высокая гидрофильность;

· невысокая стоимость.

Для получения иммобилизованных ферментов используется ограниченное число как органических, так и неорганических носителей (рис. 7.1).

НОСИТЕЛИ
ОРГАНИЧЕСКИЕ	НЕОРГАНИЧЕСКИЕ
НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ	ПОЛИМЕРНЫЕ	МАКРОПОРИСТЫЕ	ДРУГИЕ

Рис. 7.1. Классификация носителей для иммобилизованных ферментов

Органические полимерные носители. Существующие органические полимерные носители можно разделить на два класса: природные (белковые, полисахаридные и липидные) и синтетические полимерные носители (полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные).

Преимущества природных носителей: доступность, полифункциональность и гидрофильность; недостатки: биодеградируемость и высокую стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель – губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей применяют хитин. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков в качестве носителей применяют структурные протеины, – кератин, фиброин, коллаген и желатина (продукт переработки коллагена). Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании иммобилизованных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность.

Синтетические полимерные носители. Большинство синтетических полимерных носителей обладают механической прочностью, и возможностью варьирования в широких пределах величины пор. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы). К ним относятся полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры.

Носители неорганической природы. В качестве носителей наиболее часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей – легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Методы иммобилизации ферментов

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: физические (без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем) и химические (с образованием ковалентной связи между ними) (рис. 7.2).

а	б	в	г	д
Рис 7.2. Методы иммобилизации ферментов Физические методы иммобилизации: а – адсорбция; б – включение в гель; в – инкапсулирование; г – включение в липосомы; Химические методы иммобилизации: д – ковалентные связывание

Физические методы иммобилазации представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов.

Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В качестве адсорбентов используют кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Эффективность адсорбции определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя.

Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

К недостаткам адсорбционного метода относится невысокая прочность связывания фермента с носителем (при изменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции). Прочность связывания фермента с носителем может повысить предварительная модификация носителя (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами – полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мулътиэнзимных комплексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами:

· фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента; используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля;

· фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние; используют гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.

К преимуществам иммобилизация ферментов в гелях относят:

· равномерное распределение энзима в объеме носителя;

· высокая механическая, химическая, тепловая и биологическая стойкость матрицы;

· возможность многократного использования фермента, включенного в его структуру.

Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры. Сущность этого способа иммобилизации – отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента.

Наибольшее распространение получили две модификации этого метода – микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

Микрокапсулирование состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером.

Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни микрометров, а толщина мембраны – сотые доли микрометра.

Достоинства метода микрокапсулирования:

· простота;

· универсальность;

· возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования);

· возможность иммобилизовать не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток.

К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Включение водных растворов ферментов в липосомы. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях. Изучение липосом имеет большое значение для понимания закономерностей процессов жизнедеятельности клетки, поскольку значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран.

Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем – наиболее массовый способ облучения промышленных биокатализаторов.

В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.).

Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента участвовали функциональные группы, не существенные для его каталитической функции. Так, гликопротеины обычно присоединяют к носителю через углеводную, а не через белковую часть молекулы фермента.

Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента.

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксогруппами. Наиболее распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением является бромциановый метод. При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов:

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами. Первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольньте группы белков.

Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы. Наиболее часто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот.

Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрильными группами. Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связей под действием кислорода воздух:

Н—SН +НS—Ф + О₂→Н— S—S —Ф + Н₂О

Преимущества химической иммобилизации – высокая эффективность и прочность связи. Однако, методы ковалентной иммобилизации малодоступны для промышленного использования в связи со сложностью и дороговизной их применения.

Иммобилизация клеток

Использование иммобилизованных клеток исключает необходимость выделения и очистки ферментных препаратов, применение кофакторов; создает возможность получения полиферментных систем, осуществляющих многостадийные непрерывно действующие процессы.

В промышленных процессах чаще используют покоящиеся клетки (в стационарной фазе). Растущие клетки нарушают структуру носителя. Образующиеся при делении дочерние клетки, покидая носитель, загрязняют целевой продукт. Для подавления роста иммобилизованных клеток растений используют дефицит фитогормонов, а рост клетки бактерий тормозят добавлением антибиотиков.

Иммобилизованные клетки микроорганизмов применяют для биотрансформации органических соединений, разделения рацемических смесей, гидролиза ряда сложных эфиров, инверсии сахарозы, восстановления и гидроксилирования стероидов. Иммобилизованные хроматофоры используют в лабораторных установках для синтеза АТФ, а пурпурные мембраны – для создания искусственных фотоэлектрических преобразователей – аналогов солнечных батарей. Разрабатывается реактор на основе иммобилизованных клеток дрожжей для получения этанола из мелассы в котором дрожжи сохраняли бы способность к спиртовому брожению в течение 1800 ч.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: