Особенности ХТА на наличие 1,4-бензодиазепинов по нативным соединениям и их метаболитов.

О. отравления 1,4-бензодиазепинами встречаются нечасто. Однако при постановке заданий по ХТА представленных объектов экспертиза составляет определенные трудности, связанные с тем. что эти препараты в организме подвергаются разрушению и образуются различные метаболиты. При этом основными продуктами распада 1,4-бензодиазепинов являются 2-амино-5-(различно-замещенные)-бензофеноны, которые трудно дифференцировать и идентифицировать.Ниже приводим методические рекомендации Изотова Б.Н. и Волковой И.В. (1988) для демонстрации сложностей исследований биообъектов на соединения данной группы.

ХТА состоит их 2 этапов: I. по продукту гидролиза хлордиазепоксида и его метаболитов - 2-амино-5-хлорбензофенону. II. по нативному хлордиазепоксиду и его метаболитам.

Пределы обнаружения и определения при ХТА на каждом из этапов представлены в таблицах №.

Пределы обнаружения хлордиазепоксида в деструктатах органов (этап I).

Пределы обнаружения хлордиазепоксида и метаболитов при изолировании подкисленной водой (этап II)

Исследованию по 1 этапу придается отрицательное значение в ХТА. Положительный результат исследования в этом направлении указывает на присутствие производных 1,4-бензодиазепина: хлордиазепоксида, оксазепама и диазепама, образующих в процессе гидролиза 2-амино-5-хлор-бензофенон. Результаты исследования по 2 этапу позволяют идентифицировать хлордиазепоксид.

Колич. определение хлордиазепоксида и его метаболитов проводят по 2-амино-5-хлор-бензофеноиу. Методика анализа.

I. Гидролиз. К 25г (средняя проба) из 100 г гомогенизата каждого органа (печень, стенки желудка и кишечника), помещают в колбы, вносят по 50 мл 6 н. HCl и гидролизуют на глицериновой бане с обратным холодильником при 125-135°С 1 ч (печень) или 80-100 мин (желудок и кишечник). По окончании гидролиза холодильники промывают 5 мл. 2 н. HCl и промывные воды присоединяют к гидролизату. Горячий гидролизат фильтруют через ватмановский фильтр (белая лента) Остаток на фильтре трижды промывают 2 н.НСl и + гранулированный NaOH, не допуская при этом сильного разогревания гпдролизата. Устанавливают рН 6-8 по универсальному индикатору (при значениях рН выше 9образуется стойкая эмульсия).

2. Экстракция. Гидролизат экстрагируют смесью хлороформа и изоамилового спирта (100:1) трижды по 20,_; 15 и 15 мл. После добавления каждой порции экстрагента содержимое делительной воронки встряхивают 5 мин. Образовавшуюся эмульсию помещают в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 мин при 4-5 тыс. об/мин. Орг.фазу переносят в мерные колбы на 50 мл через воронку с безводным сульфатом натрия (0,5г) Объем р-ра доводят до метки и перемешивают (V₁).

3. Обнаружение. ТСХ-разделение. 1/5 и 2/5 части извлечения - V₂ выпаривают под током теплого воздуха. Остатки переносят с помощью хлороформа на «Silufol» в виде двух полос длиной в 1 и 3-4 см на расстоянии 1,5 см друг то друга. На ту же стартовую линию, рядом, наносят пятна метчика: смесь 0,1% спиртовых р-ров бензофенонов 1,4-бензодиазепина (МХБ-диазепам, АНБ-нитразепам, АБХБ-феназепам, АХБ-хлордиазепоксид) по 10-15 мкг каждого. Подвижная фаза - бензол. Пробег фронта растворителя - 10 см.

Часть хроматограммы, содержащую 2/5 части исследуемого р-ра, предназначенную для элюирования, закрывают стеклянной пластинкой. На открытой части хроматограммы с пятном метчика и второй полосой исследуемого р-ра (1/5 часть извлечения) проводят реакцию образования азокрасителя: хроматограммы обрабатывают последовательно 2н HCl, 0,1% NaNO₂ и через 5 мин – 0,5% сульфаматом аммония или насыщенным р-ром мочевины и 0,1% N-1-нафтилэтилендиаминдихлорида или щелочной р-р β-нафтола. Величины Rf бензофенонов приведены в таблице Удается обнаруживать 1 мкг хлордиазепоксида в пятне.

Не обработанную реагентом зону сорбента вырезают и помещают в пробирку с 5 мл этанола (V₃), взбалтывают 3-5 мин, переносят в кювету (1см) и снимают спектр в области 200-500 нм.

Значения величин R_f и λ_max продуктов гидролиза производных 1,4-бенздиазепина.

4. Количественное определение хлордиазепоксида. В зависимости от концентрации 2-амино-5-хлорбензофенона, которую ориентировочно рассчитывают после снятия УФ-спекгра, отбирают часть элюата (V₄) и переносят в бюкс. Этанол удаляют под током теплого воздуха. Сухой осгаток растворяют в 0,2-0,5 мл этанола и + до 3 мл 2 н HCl. Далее последовательно - 0,5 мл 0,1% NaNO₂, через 5 мин - 0,5 мл 0,5% сульфамата аммония. После добавления каждого реагента р-р интенсивно взбалтывают. Азокраситель сиреневого света образуется через 15 мин после добавления 1 мл 0,1% N-1-нафтилэтилендиаминдихлорида. Окраски устойчива 24ч.

Оптическую плотность окрашенного р-ра измеряют на СФ или ФЭКе при 550 нм в кювете 1 см.

Концентрацию хлордиазепоксида в органах определяют по формуле, где х – кол-во выделенного соединения в мг на 100г органов, А - оптическая плотность измеряемого р-ра. E_{1 см} – уд. показатель поглощения (220). Др. буквенные обозначения указаны в тексте.

Определение уд.показателя поглощения. В 3 калиброванные мерные пробирки (для 3 повторных определений) на 5 мл вносят по 0.1 мл (100 мкг) стандартного спиртового р-ра хлордиазепоксида (1 мг/мл), + по 3 мл 2 н. HCl и гидролизуют 30 мин на глицериновой бане при 125-135°С собратным холодильником. По окончании гидролиза холодильник промывают 1 мл 2 н. HCl и после охлаждения гидролизата доводят последний до 5 мл. Из каждого гидролизата в мерные пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,5, 0,75, 1 мл (2, 5, 10, 15, 20 мкг в-ва), доводят 2 н. HCl до 3 мл и проводят реакцию образования азокрасителя как указано выше. После определения плотности окрашенного р-ра при 550 нм уд.показатель поглощения вычисляют по формуле, где D - оптическая плотность р-ра; С - концентрация р-ра в весовых %, 1 - толщина поглощающего слоя в см. В качестве р-ра сравнения используют смесь реактивов. Подчинение закону Бутера наблюдается в пределах концентрации 5-20 мкг в исследуемой пробе. (Определение содержания хлордиазепоксида по бензофенону, основанное на получении азокрасителя с β-нафтолом, проводить нельзя ввиду отсутствия характерного спектра поглощения).

Исследование по нативному соединению с метаболитами (этап 2). Объекты ХТА на содержание хлордиазепоксида совместно с метаболитами являются печень, стенки желудка и кишечник.

Методика анализа. 1. И:юлирование_: 25 г мелко измельченных органов (средняя проба из 100г) заливают в стакане на 200 мл 0,5 н. HCl (рН 1) и оставляют при комн. тем-ре 1 ч, периодически перемешивая и проверяя значение рН среды. Настаивание повторяют 2 раза при тех же условиях. Извлечения объединяют, процеживают через тонкий тампон в делительную воронку на 250 мл и устанавливают рН 3 по универсальному индикатору. Экстрагируют хлороформом трижды по 15 мл. В случае образования эмульсии разделение фаз достигалось центрифугированием извлечения 10 минут при 5000 об/мин. Орг. фазу переносят в мерную колбу на 50 мл, пропуская через воронку с безводным сульфатом натрия, доводят хлороформом до метки и перемешивают. Извлечение исследуют на содержание хлордиазепоксида и метаболитов: демоксепама, десметилхлордиазепоксида и дезоксидемоксепама.

2. ТСХ.На стартовую линию ТСХ-пластинки наносят остаток 1/5 части извлечения, растворенный в миним. кол-ве хлороформа. На расстоянии 2 см от первой точки наносят с виде полос 1 см этанольные р-ры (1 мг/мл) хлордиазепоксида и его 3 метаболитов. Хроматографируют в камере с системой растворителей этилацетат-абс. этанол (9:1). Пробег растворителя 10 см. По удалении растворителя с сорбента ТСХ-пластинку обрабатывают конц. НС1 до полного увлажнения слоя силикагеля. Накрывают покровным стеклом, избегая прилипания влажною сорбента к покровному стеклу; термостатируют при 135-140°С. Через 20 мин покровное стекло снимают, а хрома-тограмму оставляют в термостате еще на 5 мин. После охлаждения пластинки слой сорбента обрабатывают последовательно реагентами для образования азокрасителя. При наличии хлордиазепоксида и его метаболитов образуются пятна сиреневого цвета, значения R_f которых представлены в таблице №.

Одновременно с первой ТСХ-пластинкой в эту же камеру помещают вторую, на стартовую линию которой наносят полосой 1,5 см остатки из 2/5 и 1/5 части извлечений В третью полосу, длиной 1см, наносят в качестве метчика смесь стандартных р-ров (1 мг/мл) хлордиазепоксида и его метаболитов. Пластинку сушат, зону сорбента, соответствующую 2/5 извлечения, фиксируют стеклянной пластинкой. Остальную часть хроматограммы обрабатывают последовательно реактивом Драгендорфа (модификация Hachebout) и10% H₂SO₄. При наличии хлордиазепоксида и его метаболитов наблюдаются пятна оранжево-красного цвета. Зону сорбента, соответствующую 2/5 части извлечения, параллельную проявленным пятнам, снимают, помещают на стеклянный фильтр (№ 4) и элюируют ацетоном дважды по 5 мл в мерную пробирку.

3 Фотометрия в УФ-области спектра. В подученных элеатах удаляют орг. растворитель, сухие остатки растворяют в 5 мл этанола и снимают спектры поглощения в УФ-области в интервале 200-400 нм против 96° этанола. Измерение в тех же условиях повторяют после добавления в кювету, включая и р-р сравнения, по 3 кап насыщенного р-ра NaOH. После снятия спектра в щелочной среде в те же кюветы + по 5 кап конц. H₂SO₄ и получают спектр в кислой среде. Результаты исследования представлены в таблице №.

4 Хроматографическая очистка. При отсутствии характерных спектров соединений по причине влияния эндогенных в-в необходимо удалить последние, используя хроматографирование полученных элюатов в метаноле. Спиртовые р-ры элюатов после снятия спектров упаривают и сухие остатки наносят на стартовую линию ТСХ-пластинки полосой 1 см. Рядом наносят 1/5 часть хлороформного извлечения. Хроматографируют в камере, насыщенной в течение 15 мин метанолом, до поднятия растворителя на 10см. После удаления растворителя под током теплого воздуха зону сорбента, соотв. 1/5 части извлечения, обрабатывают реактивом Драгендорфа и 10% H₂S0₄. Параллельно проявленным пятнам снимают сорбент в зоне расположения нанесенного элюата. Помещают на стеклянный фильтр № 4 и элюируют дважды по 5 мл ацетоном (время настаивания по 10 мин).

При исследовании хлордиазепоксида по 2-амино-5-хлорбензофенону определяется 60,5±4,3% -70,0±1,2% от введенного кол-ва, что зависит от характера анализируемого объекта: степень извлечения значительно снижается при наличии эндогенных соединений липидной структуры. При исследовании по нативному соединению и метаболитам слепень извлечения хлордиазепоксида и его метаболитов находится в интервале от 55±2,2% до 62±2,8%.

Значения R_f и спектральные характеристики хлордиазепоксида и его метаболитов.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: