Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

В последние годы появилась такая модификация ПЦР, как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Ей предшествовал вариант с флуоресцентной детекцией ПЦР-продукта в конечной точке: в реакционную смесь добавляли специфический флуоресцентный зонд и далее через 30-40 циклов определяли уровень флуоресценции.

В реакционную смесь при ПЦР-РВ также добавляется или специфический флуоресцентный зонд (TaqMan и др.), или интеркалирующий краситель (SYBR GreenI и др.), но в данном случае амплификатор позволяет детектировать флуоресценцию каждый цикл и наблюдать рост количества ПЦР-продукта в каждой пробирке, и далее по имеющейся калибровке определять точное исходное количество образца в пробе (рис. 6.7).

Прогресс в этой области позволяет использовать несколько независимых зондов в реакции, проводить одновременную детекцию нескольких ПЦР-продуктов и создавать ПЦР-системы мультиплексного формата.

Альтернативные ПЦР-методы амплификации нуклеиновых кислот

1. Лигазная цепная реакция (ЛЦР). Принцип аналогичен таковому при выполнении ПЦР, но вместо ДНК-полимеразы и dNTP используется термостабильная лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к детектируемому специфическому фрагменту цепи ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу, одновременно они комплементарны и второй паре олигонуклеотидов. После денатурации ДНК-матрицы при 95 °С олигонуклеотиды связываются специфическими фрагментами цепей ДНК-матрицы и лигируются при 50 °С. Далее эти две стадии цикла повторяются много раз, в результате чего происходит экспоненциальное возрастание соединенных ковалентной связью олигонуклеотидов. Для быстрого количественного обнаружения лигированных олигонуклеотидов применяют 2 метки: биотин на одном конце, а флуоресцеин - на другом конце лигированных

олигонуклеотидов, поэтому они связываются антифлуоресцеиновыми антителами на поверхности мембраны или микропланшета. Антибиотиновые антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой, также количественно взаимодействуют с образовавшимся фиксированным комплексом и после добавления субстрата дают окрашенный продукт.

2. Каталитическая амплификационная система, или циклическая зондовая технология (ЦЗТ), - противоположность ЛЦР, поскольку принцип состоит не в сшивании двух олигонуклеотидных зондов, а напротив, в расщеплении рибонуклеотидной комплементарной вставки при помощи фермента РНК-азы Н и получении из одного длинного ДНК-РНК-ДНК-зонда двух коротких ДНКовых олигонуклеотидов, которые затем детектируются одним универсальным дезоксинуклеотидным зондом, конъюгированным с маркерным ферментом. Достоинства метода заключаются в изотермальности реакции, исключении возможности перекрестной контаминации, быстроте проведения (менее 1 ч) и в полной автоматизации.

Преимущества РЦР перед другими методами

Для выявления нуклеиновой кислоты-мишени методом гибридизации in situ с применением радиоактивно меченного зонда необходимо, чтобы мишень присутствовала в анализируемом препарате в количестве нескольких тысяч копий. Нередко число аномальных последовательностей в препарате диагностически значимо, но меньше необходимого числа копий мишени, и гибридизация может дать ложноотрицательный результат. Для выявления уникальной нуклеотидной последовательности методом ПЦР достаточно 10 копий матрицы. К преимуществам полимеразной реакции нужно отнести следующее.

1. Метод прямой и позволяет достичь предельно возможной чувствительности (от нескольких копий до одного возбудителя в пробе).

2. Специфичность метода приближается к 100%.

3. Для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты.

4. Метод позволяет определять число копий возбудителя в пробе и тем самым наблюдать динамику.

5. Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следова-

тельно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.

6. Метод прост в исполнении, возможна его полная автоматизация.

7. Результаты получают через несколько часов, т.е. в течение одного рабочего дня.

Рис. 6.7.Сопоставление результатов ПЦР-РВ с калибровочной прямой: наблюдается рост количества ПЦР-продукта в каждой пробирке (а), определяется по имеющейся калибровке точное исходное количество образца в пробе (б)

Области применения

Метод ПЦР применяется для выявления в клинических образцах вирусов, микобактерий, простейших и бактерий, для обнаружения врожденных и приобретенных генетических нарушений, а также для идентификации личности. Сфера применения ПЦР в диагностике будет постепенно расширяться, поскольку в клинической практике все чаще имеют дело с очень небольшими по размеру биоптатами, получаемыми, например, при эндоскопических исследованиях; или это тонкоигольные аспираты и т.д. В подобных случаях обычный гистологический анализ затруднен. Перечислим, для чего может служить ПЦР.

В иммунологических исследованиях ПЦР чаще всего используется:

• для определения полиморфизма генов, белковые продукты которых участвуют в иммунологических реакциях;

• для определения экспрессии цитокинов, рецепторов цитокинов и других эффекторных молекул;

• для ДНК типирования HLA аллелей и др.

ДНК, выделенную из лимфоцитов, анализируют следующими вариантами ПЦР.

1. ПЦР-праймер со специфической последовательностью (PCRSSP).

2. ПЦР-олигонуклеотидные пробы со специфической последовательностью (PCR-SSOP).

3. ПЦР-рестрикционный анализ продуктов амплификации (PCRRFLP).

4. ПЦР-метод обратной гибридизации амплифицированного фрагмента с олигонуклеотидными зондами, фиксированными на мембране или другой твердой подложке (пластине).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: