Гибридомные биотехнологии в производстве биологически активных соединений.

Моноклональные антитела и технология гибридом

Первым этапом является иммунизация животного (например, белой мыши) тем антигеном, к которому необходимо получить моноклональные антитела. После развития иммунного ответа (что контролируется по появлению в сыворотке крови животного антител к выбранному антигену) из селезенки животного отбирают лимфоциты, смешивают с суспензией ГАТ-чувствительных миеломных клеток мыши, добавляют вещество, способствующее слиянию клеток (например, полиэтиленгликоль) и выдерживают необходимое для слияния время. Затем получившуюся смесь высевают на ГАТ-среду.

Поскольку слияние происходит неконтролируемо, в смеси могут содержаться: 1) не слившиеся В-лимфоциты из селезенки, 2) слившиеся друг с другом В-лимфоциты из селезенки, 3) не слившиеся миеломные ГАТ-чувствительные В-лимфоциты, 4) слившиеся друг с другом миеломные ГАТ-чувствительные В-лимфоциты, 5) гибридомы, являющиеся результатом слияния В-лимфоцитов из селезенки и миеломных ГАТ-чувствительных В-лимфоцитов. К размножению на ГАТ-среде оказываются способными только представители 5-й группы из присутствующих в смеси клеток, так как: первые две группы не дадут клонов из-за неспособности обычных, не раковых, клеток длительно размножаться in vitro, две вторые - в силу их чувствительности к ГАТ-среде. Зато в 5-й группе могут оказаться такие объединенные клетки, потомки которых унаследуют от миеломной клетки способность постоянно делиться, а от нормального, не ракового, В-лимфоцита -нечувствительность к ГАТ-среде.

Сформировавшиеся клоны проверяют на способность продуцировать антитела и отбирают те из них, которые дают антитела к использованному для иммунизации животного антигену. Часть клеток из каждого такого клона консервируют путем замораживания при температуре жидкого азота, а сам клон подвергают расчистке. Суть расчистки заключается в разделении клона на изолированные клетки, получении их потомства и анализе этого потомства на однородность и продукцию нужных антител. При необходимости проводят несколько последовательных расчисток получаемых дочерних клонов, причем на каждом этапе расчистки часть клеток каждого клона также консервируют, чтобы в случаях гибели клона была возможность не повторять процедуру с начала, а продолжить ее с конкретного этапа.

Полученные стабильные, не дающие расщепления клоны являются источниками гибридом, пригодных для получения абсолютно однород­ных по специфичности и изотипу антител, которые и называют монокло-нальными. Наработку нужного количества антител осуществляют либо побуждая гибридомные клетки к продукции антител в культуре, либо вводя суспензию таких гибридом в организм специально подготовлен­ных лабораторных животных.

9.Отделение биомассы:флотация,фильтрование и центрифугрование.Первым этапом в процессе очистки целевого продукта является разделение культуральной жидкости и клеточной биомассы сепарация. В некоторых случаях сепарации предшествует специальная обработка реакционной смеси, способствующая более эффективному отделению биомассы и стабилизации выделяемого продукта. Применяются различные методы сепарации. 1. Флотация. Метод используется в том случае, если клетки продуцента в силу низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях содержимого биореактора. Особые устройства (флотаторы) различной конструкции удаляют образующуюся при культивировании пену вместе с прилипшими к пузырькам газа клетками. Повышение эффективности отбора биомассы достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя механическим путем. Достоинствами метода является его экономичность, высокая производительность и возможность использования в непрерывных процессах. 2. Фильтрация. Различны применяемые в настоящее время фильтрующие системы (барабанные, ленточные, тарельчатые фильтры, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы, мембранные фильтры) основаны на одинаковом принципе – задержке биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Недостатком способа является налипание клеток на фильтре, слой которых снижает скорость протока жидкости в процессе фильтрования. Для фильтров непрерывного действия предусматриваются системы автоматической очистки от биомассы, забивающей поры. Она может сдуваться с поверхности фильтров сжатым воздухом или удаляться специальными "ножами". Существуют также фильтры для многократного или однократного периодического использования. Например, мембранные (в частности, тефлоновые) фильтры, позволяющие фильтровать очень разбавленные клеточные взвеси. Однако проблемой их использования является быстрая закупорка пор клетками, белками и другими коллоидными частицами. Приемы механического удаления материала, забивающего фильтры, при данном способе фильтрации не пригодны, так как повреждают мембраны. Приемлемым путем преодоления затруднений такого рода является покрытие мембранных фильтров гидрофильным слоем, препятствующим контакту белков (коллоидов) с поверхностью фильтра, либо обработкой фильтров гидролитическими ферментами. 3. Центрифугирование. Данный способ требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование, поэтому он применяется если: а) суспензия фильтруется слишком медленно; б) возникает необходимость максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся в ней частиц; в) требуется обеспечить непрерывный процесс сепарации, когда фильтры рассчитаны на периодическое действие. Центрифугирование и фильтрация в некоторых биотехнологических процессах осуществляется в комбинации, т. е. применяются фильтрационные центрифуги, в которых разделение жидкой и твердой фазы основано на двух процессах фильтровании и центрифугировании. Довольно широко используются приемы, где разделение обеспечивается лишь центробежной силой. Наиболее перспективными в этом отношении являются центрифуги-сепараторы, в которых отделяемая биомасса оседает па стенках вращающегося цилиндра или специальных тарельчатых вставках.

Использование достижений генной инженерии в производстве белков для медицины и пищевой промышленности.

Пищевая промышленность:

Спектр продуктов питания, получаемых при помощи

микроорганизмов, обширен: от вырабатываемых с древних времен за

счет брожения хлеба, сыра, йогурта, вина и пива до новейшего вида

пищевого продукта – грибного белка микопротеина. Микроорганизмы

при этом играют важную роль: используются продуцируемые ими

ферменты или другие метаболиты, с их помощью сбраживается

пищевое сырье, а некоторые из них выращиваются для

непосредственного потребления.

В пищевой промышленности для осуществления процессов

применяют как культуры микроорганизмов, так и дикие формы,

содержащиеся в значительном количестве в сырье, которые

размножаются при создании надлежащих условий. Последний способ

особенно характерен для традиционных бродильных производств,

зародившихся во времена, когда о микробах еще ничего не знали. В

промышленном производстве такие процессы обычно ведутся под

гораздо более строгим контролем.

До недавнего времени биотехнология использовалась в пищевой

промышленности с целью усовершенствования освоенных процессов

и более умелого использования микроорганизмов, но будущее здесь

принадлежит генетическим исследованиям по созданию более

продуктивных штаммов для конкретных нужд, внедрению новых

методов в технологии брожения.

Таким путем можно повысить выход и качество выпускаемой

продукции и освоить производство новых ее разновидностей.

Одноклеточный белок используют:

Производство молочных продуктов.

Пищевые добавки и ингредиенты

Подкислители.

Аминокислоты.

Витамины и пигменты.

Усилители вкуса.

Медицина

1 Производство и применение антибиотиков.К настоящему времени выделены антибиотики, эффективные в отношении грамотрицательных бактерий: стрептомицин,цефалоспорин.2 Производство и применение гормонов.

Применяемые методы биоконверсии наряду с традиционными химическими превращениями позволили получить многие стероиды более простыми и дешевыми способами. Именно благодаря этому такие стероиды, как дексаметазон, тестостерон, эстрадиол могут сегодня широко применяться в клинике.3 Ферменты.4 Иммунологический анализ.Он позволяет определить очень небольшие количества вещества путем вытеснения меченногорадиоактивным изотопом антигена при добавлении все возрастающего количества немеченого испытуемого или стандартного антигена.

Диагностика злокачественных новообразований. Были выделены антитела к клеткам злокачественной меланомы человека (рак кожи), которые не давали перекрестной реакции с нормальными клетками кожи.

Введение радиоактивных и флуоресцентных меток в опухолеспецифичные антитела облегчает выявление метастазов и оценку первичных реакций опухолей в ходе лечения.Развитию новых способов лечения может способствовать направленное введение лекарственных препаратов, присоединенных к антителам против данных опухолей.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: