Сделай Сам Свою Работу на 5

Дифференциация патогенных стафилококков от непатогенных

СПбГАВМ

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Учебно-методическое пособие

К лабораторно-практическим занятиям

По ветеринарной микробиологии

Схемы лабораторной диагностики

Бактериальных болезней

ПАТОГЕННЫЕ СТАФИЛОКОККИ

Патогенные стафилококки вызывают гнойно-воспалительные процессы различной локализации: местные – фурункулы, абсцессы, экземы и др.; в отдельных органах – ангины, отиты, маститы, эндометриты, циститы, пневмонии и др.; общее поражение – пиемию и септицемию. При накоплении в пищевых продуктах - пищевые токсикозы. Восприимчивы все виды животных, а также человек.

КЛАССИФИКАЦИЯ: сем. Micrococcaceaeрод: Staphylococcus - 25 видов

· S.aureus - наиболее патогенный, чаще других явл. возбудителем.

· S.epidermidis – условно патогенный;

· S.saprophyticus – гнилостный mi, очень редко вызыв. болезни.

Патогенез и факторы вирулентности:

Микроорганизм проникает в организм через поврежденную кожу и слизистые оболочки; энтеротоксины – с пищевыми продуктами (мясо, молоко и др.); стафилококки образуют и выделяют экзотоксины: гематоксин, лейкоцидин, энтеротоксин, некротоксин; ферменты вирулентности: коагулазу, фибринолизин, гиалуронидазу, ДНК-азу, лецитиназу.

Методы диагностики

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД:

Материал для исследования:раневой экссудат, гной абсцессов, ран, молоко при маститах, выделения из половых органов при эндометритах, кровь при септицемии;

Микроскопия:метод окраски - простой метод и по Граму; микрокартина: шаровидные клетки располагаются беспорядочно и в виде скоплений. напоминающих «виноградные грозди»,Гр+; спор не образуют; капсулу не образуют, неподвижны.

Культивирование:посев на простые питательные среды: МПА, МПБ; на кровяной МПА. Стафилококки – факультативные анаэробы; оптимальная t 370C; срок культивирования 18-20 часов. галофилы (солевыносливые), могут расти на МПА 10% NaCl. Элективные среды – желточно-солевой агар Чистовича, молочно-солевой агар Петрович с 6,5% NaCl.

Культуральные свойства:На МПА – колонии округлые,выпуклые, блестящие, диаметром 2-5 мм, с ровным краем, могут быть окрашены в золотистый, белый, лимонно-желтый цвет за счёт каротиноидного пигмента, нерастворимого в воде. На МПБ – равномерное помутнение, выпадение рыхлого хлопьевидного осадка. На кровяном агаре патогенные штаммы стафилококков как правило образуют зону бета-гемолиза.



Биохимические свойства S.aureus:протеолитическая активность (пептонизация молока, разжижение желатины). Активная ферментация углеводов, в т.ч. ферментация маннита без газа (в анаэробных условиях); каталазная активность; лецитовителлазная реакция (образование помутнения вокруг колоний) на среде желточно-солевой агар Чистовича. ДНК–зная активность; Плазмокоагуляция (свёртывание) цитратной плазмы крови кролика.

БИОПРОБА:

1. Дермонекротическая проба.Кроликам вводят 0,2 см3 2-х млрд.взвеси смыва агаровой культуры в кожу на боку (предварительно выбрить шерсть). Через 24 часа наблюдают образование инфильтрата и некроза, окружённый зоной воспаления.

2.Летальная проба.Кролику вводят в/в фильтрат 2-3-х сут. бульонной куль

туры стаф. 0,75 см3 на кг массы тела: происходит быстрая гибель «на игле»

3.Вирулентность для мышей.Мышам вводят суточную бульонную культу

ру стафилококка; через 5-10 сут. развивается абсцесс и происходит гибель.

4. Проба на котятах.При пищевых токсикозах у людей – (выпаивание мо

лока с энтеротоксином вызывает рвоту и энтерит

ФАГОТИПИРОВАНИЕ Имеется 22 типа фагов – вирусов, паразитирующих

на стафилококках и разрушающих их. Они используются для диагностики

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ И АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ МЕТОДЫ:в ветеринарии не

использ., в медицине – РДП в агаровом геле с антитоксич. сыворокой, ИФА.

БИОПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ:

1.Стафилококковый антивирус - фильтрат старой бульонной культры;

2. Аутовакцина –от животного выделяют возбудителя, инактивируют его нагреванием и вводят больному.

3. Стафилококковый анатоксин: токсин обезвреживают формалином и применяют как вакцину.

4. Стафилококковый и комплексный пиобактериофаг для лечения.

Дифференциация патогенных стафилококков от непатогенных

Тесты Патогенные стафилококки Непатогенные стафилококки
Лецитиназная активность на ЖСА Чистовича + -
Коагуляция цитратной плазмы кролика + -
Гемолиз на кровяном агаре + -
Наличие фермента ДНК-азы + -
Пигментообразование + -
Ферментация маннита + -
Дермонекротическая проба на кролике + -
Летальная проба на кролике + -
Вирулентность для мышей + -
Фаготипирование + -

ПАТОГЕННЫЕ СТРЕПТОКОККИ.

Патогенные стрептококки – возбудители гнойно-воспалительных процессов различной локализации (ангина и скарлатина у человека, мыт лошадей, маститы у животных, стрептококковая септицемия птиц, кроликов, стрептококковый полиартрит), а также смешанных и вторичных инфекций (абсцесс, фурункул, нефрит, пиемия, сепсис и др.). Фекальные стрептококки могут вызвать воспаление кишечника и мочеполовых путей. При накоплении в пищевых продуктах стрептококки вызывают пищевые токсикозы (токсикоинфекции).

КЛАССИФИКАЦИЯ Сем. Streptococcaceae, Род. Streptococсus, включает 17 серологических групп по Лендсфилд (A,B,C,D,E и т.д.)

Важнейшие виды:

· гр. А. Str.pyogenes (гнойно-воспалительные процессы, ангина)

· гр. B. Str. agalactiiae (мастит коров);

· гр.С. Str. equi (мыт у лошадей).

· гр.D Enterococcus faecalis(энтероколиты, циститы),

· без группы Str. pneumoniae (диплококковая септицемия, пневмонии)

Патогенез и факторы вирулентности:

Многие патогенные стрептококки относятся к нормальной микрофлоре кожи и слизистых оболочек и проявляют свою патогенность при снижении общей резистентности. Образуют экзотоксины – гемолизин, лейкоцидин, летальный некротоксин; продуцируют ферменты вирулентности – гиалуронидазу, фибринолизин, ДНК-азу, РНК-азу, нейрамидазу и др. Образуют термостабильные эндотоксины.

Методы диагностики:

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД:

Материал для исследования:

при жизни – гной, молоко, слизь, соскобы эпителия, раневой экссудат, моча, кровь, кал; посмертно – пораженные органы.

Микроскопия:методы окраски - по Граму и на капсулу; микрокартина: мелкие шаровидные клетки до 1 мкм, в виде коротких и длинных цепочек. Особенно длинные цепочки образует Str. еqui – возбудитель мыта лошадей. Str. pneumoniae – расположенные попарно mi почти треугольной формы; Гр+; Сп-; капсулу образуют Str. pneumoniae (возбудитель диплококковой септицемии молодняка) и, иногда, стрептококки серологической группы «С»; стрептококки неподвижны.

Культивирование:посев на обогащенные питательные среды: МПА и МПБ с сывороткой крови, с сахаром, с кровью; особенности выделения возбудителя:факультативные анаэробы; оптимальная t 37oС; предпочтительна атмосфера с 10% СО2.18-24 ч.

Культуральные свойства:на плотных средах – мелкие, прозрачные, круглые колонии с ровным краем – «росинчатые»; на жидких средах – незначительное помутнение, затем просветление, крошковидный, крупитчатый осадок.

Биохимические свойства:Стрептококки ферментируют углеводы – глюкозу, сахарозу, маннит и др. (образуют кислоту без газа); не обладают протеолитическими свойствами; на кровяном МПА вызывают бета-гемолиз (прозрачная зона) или альфа-гемолиз (зеленоватая зона).

ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ ТЕСТЫ:

Применяются особые биохимические тесты для дифференциации отдельных видов стрептококков:

· для Str.pyogenes – гидролиз гиппурата натрия;

· для Str.agalactiae – свёртывание молока и CAMP-тест на скрытую гемолитическую активность;

· для Str. equi – отсутствие роста на среде с добавлением мытного анатоксина;

· для Str. pneumoniae – лизис 10%-й желчью;

· для патогенных энтерококков– редукция(обесцвечивание)метиленового молока, рост после прогревания при 60оС и т.д.

БИОПРОБА:заражают подкожно или в/б белых мышей, кроликов, наблюдают гибель. Биопроба не всегда показательна.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ:Реакция преципитации в капиллярах для определения серологической группы по Лендсфилд. РА.

БИОПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ:

Мытный антивирус для лошадей;

Полужидкая формолвакцина против стрептококкоза;

Поливалентная ассоциированная формолвакцина против сальмонеллёза, пастереллёза и диплококковой септицемии молодняка.

 

СИНЕГНОЙНАЯ ПАЛОЧКА

Широко распространена в природе. Очень устойчива к дезинфектантам и антибиотикам. Поражает макроорганизм при снижении иммунитета.Вызывает септическую болезнь норок – псевдомоноз. Осложняет течение ожоговой болезни, онкологич. процессов, заживление ран. Вызывает отиты, экземы, маститы, эндометриты, пневмонии, сепсис. Может быть причиной пищевых токсикоинфекций. Одна из наиболее опасных госпитальных инфекций.

КЛАССИФИКАЦИЯ: сем. Pseudomonadaceae,род Pseudomonas,

  • вид Pseudomonas aeruginоsa

Методы диагностики:

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД:

Материал для исследования: гной и экссудат из очагов поражения, моча,сперма,молоко,паренхим.органы,трубчатая кость,трупы мелк.ж.

Микроскопия:Мелкая полиморфная, Гр - палочка, располагается одиночно, беспорядочно, споры -, капсула -, очень подвижная.

Культивирование. Аэроб.Растёт при температуре от 20 до 44оС на простых пита-тельных средах. Очень неприхотлива, растёт даже при пересеве на физраствор NaCl.

Культуральные свойства.При росте выделяет водорастворим. пигменты: сине-зелёный - пиоцианин; флуоресцирующий желтый - пиовердин; красный - пиорубин; чёрно-коричневый - пиомеланин.Выделяет запах жасмина или земляничного мыла.

На МПБ интенсивное помутнение, постепенное окрашивание среды в зеленовытый цвет. На дне слизистый осадок, при встряхивании он поднимается в виде косички. На поверхности может быть пленка.

На МПА средние и крупные, серые, плоские колонии с матовой поверхностью, неровными краями. Колонии и среда прокрашиваются в зелёный цвет,иногда с радужным отблеском.

Биохимические свойства. Синегнойная палочка обладает оксидазной активностью. Имеет протеолитическую активность (вызывает порчу пищевых продуктов). Выделяет аммиак. МПЖ – разжижает воронкой. Молоко – свертывает и пептонизирует. На кровяном агаре часто гемолиз.

Сахаролитическая активность слабая– расщепляет только глюкозу и арабинозу, поэтому относится к группе «неферментирующих» микробов.

ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ ТЕСТЫ:

  • рост при 44оС;
  • тест с хлороформом (в МПБ хлороформ растворяет пиоцианин и опускается на дно в виде голубой жидкости);
  • положительный тест на окисление глюкозы при отсутствии анаэробной ферментации (О/Ф тест) .

БИОПРОБА: заражение белых мышей (п/к, в дозе 0,2 мл) смывом с МПА.

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА: РА на стекле с поли- и моновалентными сыворотками и живой культурой.

БИОПРЕПАРАТЫ:Псевдомонозная формолвакцина для норок; Диагностические сыворотки. Псевдомонозный лечебный бактериофаг, пиобактериофаг.

ПРОТЕЙ

Широко распространён в природе. Типичный гнилостный mi. Вызывает гниение органических веществ, порчу пищевых продуктов. При ослаблнии защитных сил макроорганизма может вызывать гнойно-септические процессы(у новорожденных, недоношенных, у старых животных, при онкологических процессах. Выделяется при циститах, пиелонефритах, эндометритах, энтероколитах, при запущенных раневых процессах(гниение ран). При употреблении в пищу несвежих, ипорченных пищевых продуктов может быть причиной токсикоинфекций.Является санитарно- показательным микр-мом – индикатором гнилостного загрязнения воды, почвы.

КЛАССИФИКАЦИЯ: Сем. Enterobacteriaceae, Род. Proteus, виды:

  • Proteus vulgaris(протей обыкновенный)
  • Proteus mirabilis(протей удивительный)

Методы диагностики:

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД:

Материал для исследования: раневой экссудат, моча, истеч. из влагалища, фекалии, содержимое кишечника, паренхиматозные органы, аборт. плод. Пищевые продукты – при исследовании на свежесть. Корма. Смывы с поверхностей.

Морфология:Полиформные (разной длины) палочки, Гр.-, располагаются в мазке беспорядочно, одиночно, иногда образуют нити. Споры -, капсула -, подвижность ++ ( перитрих)- протей феноменально подвижен!!

Культивирование и культуральные свойства:Хорошо растет на простых питательных средах..НаМПБ–интенсивное помутнение, хлопьевидный осадок, на поверхности пленка, запах тухлого мяса. МПАрост ползучий, вуалеобразный, в виде тонкой, блестящей бело-серой плёнки, покрывающей всю поверхность среды. Для получения чистой культуры делают посев по Щукевичу в конденсационную жидкость на дне скошенного агара – на следующий день протей «поднимается» по скосу, образуя плёнку.

Биохимические свойства.Обладает ярко выраженнымипротеолитическими свойствами:Выделяет Н2S, индол, разжижает желатину; расщепляет мочевину, пептонизирует молоко. Расщепляет аминокислоту фенилаланин, что важно для диагностики. Расщепляет многие сахара на средах Гисса, но не изменяет лактозу и маннит.

Для ограничения ползучего роста протея поверхность питательных сред обрабатывают этиловым спиртом, подсушивают, а также используют элективные среды с желчью и желчными солями (среда Плоскирева).

ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ ТЕСТЫ:

· Посев по Щукевичу в конденсационную воду скошенного агара (ползучий рост)

· Рост на трёхсахарном агаре Олькеницкого (скос малиновый, столбик чёрный)

· Расщепление фенилаланина; зелёное окрашивание при нанесении реактива хлорида железа на агар с фенилаланином.

БИОПРОБА:Б.мышам п/кож или в/брюшинно 0,5 мл бульонной культуры–гибель.

СЕРОДИАГНОСТИКА– РСК; РА со специфическими сыворотками

БИОПРЕПАРАТЫДиагностические сыворотки. Аг-диагностикумы для РА. Потейные лечебные бактериофаги. Пиобактериофаг.

ООИ СИБИРСКАЯ ЯЗВА

СИБИРСКАЯ ЯЗВА – АНТРАКС - острая инфекционная болезнь животных и людей. Заражение при контакте, при ранениях, укусах насекомых, алиментарно, аэрогенно. Характеризуется признаками септицемии, интоксикации. Условно различают 3 формы с.я.: кожная – образование отёков и карбункулов (нарывов с чёрным центром), кишечная и лёгочная (в этих случаях очаги воспаления образуются в кишечнике или лёгких, быстро возникает септицемия, что ведёт к гибели.) Наиболее восприимчивы к с.язве к.р.с., м.р.с., верблюды, дикие травоядные, лошади. У свиней чаще атипичная форма в виде ангины, плотоядные малочувствит.

КЛАССИФИКАЦИЯ: семейство Bacillaceae,род Bacillus,

· вид Bacillus anthracis

Факторы вирулентности:образование капсулы и экзотоксина.

Методы диагностики:

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД.

Материал для исследования:Вскрывать трупы при подозрении на сибирскую язву запрещено: опасность распространения спорообразующего возбудителя во внешней среде!!

1.При жизни у больного животного–берут капли крови из уха в виде 10-12 толстых мазков на предм.стёклах;высушить,сложить мазками внутрь между спичек,уложить в банку,укупорить,сделать надпись«Мазок нефиксирован!»

2. От трупа – ухо, отрезанное с той стороны, на которой лежит труп; пред-варительно его туго перевязывают у основания в 2-х местах, подкладывают снизу поддон, отрезают между лигатурами, место отреза прижигают; ухо заворачивают в слегка увлажнённую дезинфектантом ткань и помещают в герметичную тару. + мазки крови из надреза уха.

3. От трупов и туш свиней – участки отёчной соединительной ткани гортани, миндалин, заглоточные и подчелюстные лимфоузлы.

4. При подозрении на с.я. в ходе вскрытия трупа – вскрытие прекращают, берут для исслед. кусочки селезёнки, печени, изменённые лимфоузлы, кровь.

Посуду с материалом помещ. во влагонепрониц. тару, опечатывают, отпр. в лабораторию с нарочным с сопроводительным документом. + звонок. В лаборатории такой материал исследуют вне очереди, любой степени свежести.

Микроскопия:Окраска по Граму, на капсулу по Ребигеру и на спору. Морфология Bacillus anthracisзависит от материала, из которого деланы мазки.

1. В мазках из крови и свежего пат.материала – крупные Гр+ палочки в виде коротких цепочек, по 2-3. Концы клеток, обращенные в цепочке друг к другу как бы «обрублены», а снаружи – закруглены. Имеется КАПСУЛА, общая для всей цепочки. Неподвижные.

2. В пат.мат. от свиней или несвежем – форма клеток часто атипичная: Гр+ палочки, толстые, изогнутые, зернистые, со вздутиями, +«тени микробов».

3. В молодой к-ре с МПА или МПБ–длинные, переплетающиеся цепочки из крупных Гр+ палочек, иногда утолщен. на концах и напомин. «бамбуковую трость».

4. В старых культурах при доступе О2 образуются округлые эндоспоры, затем вегетативные части микробных клеток отмирают, остаются споры.

Культуральные свойства:B.anthracisфакультативный анаэроб, t оптимум 35-36оС, неприхотливый к питательн.средам, время роста 18-24 ч.

На МПБ – среда прозрачная, на дне осадок в виде «комочка ваты».

На МПА – крупные,матовые серо-белые колонии в R-форме с локонообразным, бахромчатым краем; под малым увелич. микроскопа характеризуются как «голова Медузы»,«львиная грива». На кровяном агаре гемолиза нет.

Для выявления способности образовывать капсулы – посев на специальные кровяные среды типа среды ГКИ. На них образ. гладкие колонии в S-форме + капсула.

Биохимические свойства.Арабиноза+, ксилоза+, гидролиз желатина (рост в виде «перевёрнутой ёлочки»), лецитиназа-, уреаза+;

Тест «феномен жемчужного ожерелья» (+). Для этого - посев на пенициллиновый агар. На вырезанные кусочки такого агара, помещенные на предметные стёкла в чашках Петри, делают посев 3-х часовой испытуемой бульонной культуры. Через 1-3 часа прямо на поверхность агаровой пластинки с посевом помещают покровное стекло и препарат изучают под микроскопом.Чувствит. к пенициллину клетки B.anthracis принимают форму шара (образуя сферопласты), цепочки имеют вид «ожерелья».

Фосфатазная активность (-). Тест на фосфатазную активность: посев на среду с фенолфталеин-фосфатом (ФФФ-агар). После получения колоний на этой среде под крышку вносят каплю нашатырного cпирта. Фосфатазаположительные колонии розовеют, а колонии B.anthracis остаются белыми.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД(B.anthracis вирулентна, антракоиды–нет)

Одновременно с посевом материала на пит.среды суспензию исслед. материала в физ. растворе вводят 2-м белым мышам п/к в спину(0,2-0,5 мл)или морским свинкам п/к в живот(0,5-1,0 мл),гибель через 1-3 суток от септицемии. Наблюдение за живыми до10 сут. Так же проводят заражение выделенной культурой возбудителя.

Фагодиагностика: используются фаги К-ВИЭВ, Гамма МВА.При нанесении специфического фага на зону посева культуры–отсутствие роста.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД:

1. Прямой МФА и ИФАдля исследования материала из очага поражения.

2. РДискП с полученной чистой культурой для её идентификации.

3. РП по Асколи для исследования кож.сырья и пат.материала (ухо).

Если материал несвежий, культуру возбудителя сибирской язвы бывает выделить невозможно из-за произошедшего лизиса микроорганизмов. В этом случае также применяют РП по Асколи.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД: ПЦР – обнаружение генов, кодирующих синтез токсина и капсулы.

АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ МЕТОД:Применяется только у людей: аллерген – антраксин п/к в предплечье (как реакция Манту). У больных, переболевших и привитых – зона воспаления > 15 мм.

БИОПРЕПАРАТЫ:

1. Живая вакцина из бескапсульного эталонного штамма СТИ.

2. Живая вакцина из штамма 55.

3. Вакцина ГНКИ.

4. Ассоциированная живая жидкая вакцина против сибирской язвы и эмкара КРС.

Гипериммунная лечебно-профилактическая сыворотка и гамма-глобулин.

Диагностические биопрепараты: преципитирующая сыворотка и стандартный Аг для РП, люминесцирующие сыворотки для МФА, диагностические бактериофаги.

 



©2015- 2019 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.