ФЕРМЕНТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

В.К. Османов

ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Учебно-методическое пособие

Нижний Новгород

Издательство НижГМА

УДК 615.014У79

ББК

Авторы:

доцент кафедры управления и экономики фармации и фармацевтической технологии НижГМА, д.х.н. В.К.Османов

Рецензенты:

Рекомендовано Центральным методическим советом НижГМА

(протокол № от

Османов В.К.

Инженерная энзимология: учебно-методическое пособие / В.К. Османов. - Н. Новгород: Изд-во Нижегородской гос. медицинской академии, 2014. - с.

ISBN

Рассмотрены основные области использования ферментных препаратов и иммобилизованных биокатализаторов в медицине и производстве лекарственных препаратов и пищевых продуктов. Издание предназначено для студентов фармацевтических факультетов вузов по специальности 060301 «фармация», дисциплине «биотехнология»

УДК

ББК

Османов В.К.

Нижегородская государственная

ISBN медицинская академия, 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение.................................................................................................5

Ферменты и способы их получения.....................................................6

Рибозимы...............................................................................................13

Инженерная энзимология, ее задачи...................................................17

Иммобилизованные ферменты............................................................19

1. Носители для иммобилизации ферментов........................................................19

2. Методы иммобилизации ферментов..................................................................21

Иммобилизация клеток.........................................................................25 Промышленные процессы с использованием

иммобилизованных ферментов и клеток............................................27

1. Получение глюкозофруктозных сиропов...........................................................28

2. Биотрансформация других углеводов...............................................................28

3. Получение L-аминокислот из их рацемических смесей...................................31

4. Получение L-аспарагиновой кислоты................................................................32

5. Получение L-аланина...........................................................................................32

6. Получение органических кислот........................................................................33

7. Получение антибиотиков....................................................................................35

8. Трансформация стероидов..................................................................................38

9. Получение ферментов.........................................................................................39

10. Применение иммобилизованных клеток для

утилизации отходов...........................................................................................40.

11. Биогеотехнология..............................................................................................43

12. Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов.................................45.

13. Иммобилизованные ферменты в медицине....................................................48.

Реакторы с иммобилизованными клетками.......................................49

Мембранные реакторы.........................................................................54

Полимерные биоматериалы.................................................................56

1. Получение гемосовместимых полимерных материалов.................................56

2. Использование радиационного сшивания для получения

полимерных биоматериалов................................................................................58

3.Получение полимерных имплантантов...............................................................60

4. Иммобилизация лекарственных препаратов................................................... ..61

5. Иммобилизация компонентов крови...................................................................62

6. Получение “умных” полимеров и их использование для

иммобилизации биологически активных веществ.........................................62.

Рекомендуемая литература...................................................................64

Контрольные вопросы...........................................................................65

Тестовые задания...................................................................................66

Ответы на тестовые задания.................................................................68

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

масс.% – массовые проценты

а.е.м. - атомная единица массы

атм. - атмосфера

рН - водородный показатель

НАДН - кофермент никотинадениединуклеотид

мм рт. ст. - миллиметр ртутного столба

РНК - рибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

М - молярность раствора

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АДФ - аденозиндифосфорная кислота

6-АПК - 6-аминопеницилланова кислота

БАВ - биологически активные вещества

ВВЕДЕНИЕ

Инженерная энзимология – это новое научно-техническое направление в битехнологии, появление которого связано с необходимостью интенсификации биотехнологических процессов. Задачи инженерной энзимологии - конструирование органических катализаторов (энзимов) с заданными свойствами на основе ферментов и полиферментных систем, выделенных из клеток или находящихся в них. Термин "заданные свойства" имеет в виду, что эти свойства задаются практическими потребностями в данном катализаторе, условиями проведения ферментативного процесса, специфичностью, необходимой производительностью и т.д. Инженерная энзимология основана на принципах органического и ферментативного катализа, химической технологии, биотехнологии и биохимии и со времени своего зарождения целиком обращена к практике. Хотя основная направленность современной инженерной энзимологии – использование каталитической активности иммобилизованных ферментов и клеток, ее рамки гораздо шире. Цель этой дисциплины – разработка научных основ применения ферментных катализаторов для создания новых биотехнологических производств и прежде всего производства лекарств, новых методов в диагностике и терапии, органическом синтезе и др., а также решение фундаментальных проблем энзимологии при помощи иммобилизованных ферментов.

ФЕРМЕНТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Ферментами называются вещества биологического происхождения, представляющие собой соединения белковой природы и являющиеся специфическими катализаторами. Для большинства из них структура не является до конца установленной. Однако существование так называемой белковой "составляющей" - неотъемлемой части биологического катализатора мож­но считать доказанным для большинства промышленно получаемых ферментных препаратов. Практически все попытки "очистить" эти препараты от соединений белковой природы приводили к потере ихкаталитической активности.

Все основные источники получения ферментов можно разделить на три ос­новные группы:

1. Ткани животных как отход мясоперерабатывающей промышлен­ности. Прежде всего, это богатые ферментами поджелудочная железа и слизистая оболочка желудка.

2. Некоторые растения. Например, такие гидролитические ферменты, как папаин и рицин извлекают соответственно из сока дынного и инжирного дерева, из ячменя - амилазу.

3. Микроорганизмы (бактерии, дрожжи, микрогрибы).

Выбор источника получения того или иного фермента предполагает учет ряда требований, предъявляемых к чистоте получаемого препарата, потребности в нем, стоимости сырья, проведения процессов выделения и очистки готового продукта.

Из всех вышеперечисленных источников ферментов наибольшее практическое значение имеют микроорганизмы - продуценты ферментов. Их широкое использование обусловлено, прежде всего, их доступностью, возможностью организовать более эффективное промышленное производство на относительно дешевом сырье и управление, процессом биосинтеза, используя, различные продуценты ферментных препаратов. Использование микроорганизмов значительно расширило круг получаемых ферментных препаратов сразличным спектром действия. Только с их помощью удалось получить такие ферменты, как целлюлазы и глюкозоизомеразы.

В качестве продуцентов ферментов, как правило, выбирают те штаммы-мутанты, полученные путем направленной селекции, которые обеспечивают максимальный выход целевого продукта при использовании стандартного оборудования. При этом штаммы-мутанты получают как традиционным путем с использованием таких широкоизвестных методов воздействия, как облучение УФ светом, γ- и рентгеновскими лучами, обработкой клеток различными химическими агентами (этилимином, диметилсуфатом, гидроксиламином, диазометаном, оксидом азота и пр.), изменением температуры и величины рН, так и методами генной инженерии.

В качестве продуцентов ферментов могут использоваться различные микроорганизмы. Для получения амилолитических и протеолитических ферментных препаратов в промышленности наиболее часто используют различные штаммы гриба рода Aspergillusи бактерий Bacillus. У бактерий короче цикл развития, на их основе легче получать мутанты.

Технология получения ферментных препаратов микробным синте­зом обязательно включает в себя стадию промышленного культивирования соответствующего микроорганизма. В условиях промышленного производства значительное количество продуцента получают одним из следующих двух способов:

- культивирование на поверхности твердых питательных средах (поверхностный способ выращивания продуцента),

- культивирование соответствующего продуцента в большом объеме жидкой фазы, содержащей все необходимые для нормального роста и развития микроорганизма питательные вещества (глубинный способ выращивания продуцента).

Рис.1 Принципиальная технологическая схема процесса глубинного культивирования микроорганизмов

Смеситель питательной среды; 2 – колонна для непрерывной стерилизации потока питательной среды острым паром; 3 - теплообменник – выдерживатель; 4 – теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 – инокуляторы (посевные аппараты); 6 – индивидуальный фильтр для очистки воздуха, подаваемого в инокулятор; 7 – реактор – ферментер; 8,9 – насосы; 10 – масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 – компрессор; 12- головной фильтр для очистки воздуха

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) вне клеток, поэтому их можно использовать как катализаторы в различных химических процессах и медицине. Такие биологические катализаторы неток­сичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье (в том числе и отходы), в связи, с чем их применение в промышлен­ности выгодно с экономической и экологической точек зрения. При использовании ферментов вместо клеток, в биореакторах не нужны системы аэрирования и значительно проще поддерживать температурный режим. Вместо сложной по составу культуральной жидкости, содержащей компоненты питательной среды, клетки и продукты их метаболизма, процесс протекает фактически в водном растворе трансформируемого вещества, что значительно упрощает и удешевляет процессы выделения и очистки целевого продукта.

Основным недостатком использования чистых ферментов, помимо сложности и дороговизны их получения, является то, что с их помощью можно осуществлять только простые одностадийные процессы биотрансформации. Совместное использование в одном процессе нескольких разных ферментов, как правило, неэффективно, так как каждый фермент требует для себя вполне определенные, часто взаимоисключающие условия (температура, рН). Процессы биосинтеза таких веществ как антибиотики, витамины, терпены включают в себя десятки и даже сотни стадий, многие из которых до сих пор не установлены. Поэтому использование чистых ферментов не может заменить клеточный биосинтез.

По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из нескольких тысяч известных в настоя­щее время ферментов наиболее широко в промышленности используются различные гидролазы, которые можно разделить на четыре основные группы ферментных препаратов.

1. Амилолитические ферментные препараты.К этой группе препаратов относятся α- и β-амилазы и глюкоамилаза. Их используют для гидролиза крахмала и гликогена. В процессе гидролиза сначала образуются более простые полисахариды - декстрины, а в последующем - глюкоза. При этом α-амилаза гидролизует без определенного порядка α-1,4-глюкозидные связи с образованием декстринов, мальтозы и глюкозы, β-амилаза отщепляет остатки мальтозы, а глюкоамилаза - остатки глюкозы от концевых частей молекул полисахарида.

Наиболее широкое применение эти препараты нашли в пищевой промышленности (производство патоки и глюкозы).

2. Протеолитические ферментные препараты.Эта группа ферментов относится к гидролазам. Они обладают такой важной особенностью, как высокоселективное воздействие на некоторые пептидные связи белковых молекул и пептидов. Например, пепсин способствует гидролизу пептидных связей с остатками ароматических аминокислот, трипсин катализирует гидролиз пептид-ной связи между остатками аминокислот аргинина и лизина. Ферментов, входящих в этот класс, очень много. Их классифицируют, в основном, по способности проявлять максимум ферментативной активности в определенной области рН раствора. Кислые протеазы проявляют максимум активности в интер-вале рН раствора от 1,5 до 3,0, нейтральные - 6,5-7,5, щелочные - от 8,0 и выше.

Протеазы нашли свое применение в различных отраслях народного хозяйства: в пищевой и легкой промышленности (предварительная обработка свежего сырого мяса и шкур, животных в кожевенной промышленности), в химической промышленности при получении синтетических моющих средств с добавками протеолитических ферментных препаратов, в здравоохранении при лечении некоторых воспалительных процессов, ожогов, тромбозов,

3. Пектолитические ферментные препараты.Пектолитические ферментные препараты используются для расщепле­ния пектиновых веществ, содержащихся в стеблях растений (льна), в различных корнеплодах, фруктах. К ним относятся пектин, пектиновые кислоты и протопектин. Пектиновая кислота - это полимер галактурононой кислоты. Пектин - это полностью или частично этерифицированная метиловым спиртом пектиновая кислота. Протопектин представляет собой комплекс с целлюлозой и белковыми веществами. Строение комплекса пока полностью не установлено.

Пектиновые вещества имеют молекулярную массу от 20000 до 200000.

Все пектиназы делятся на две группы - гидролазы и трансэлиминазы. Первые катализируют процесс отщепления метоксильных групп (пектинэстераза) или обеспечивают разрыв α-1,4-гликозидных связей (полигалактуроназы). Вторые осуществляют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей (пектинтрансэлиминазы).

Препараты нашли свое применение в легкой промышленности при вымачивании льна, в пищевой промышленности (осветление вин, консервирование фруктовых соков).

4. Целлюлолитические ферментные препараты.Целлюлолитические ферментные препараты используются при обработке целлюлозы. Сама целлюлоза или клетчатка представляет собой полисахарид общей формулы (С₆Н₁₀О₅)_n и содержится в клеточных стенках растений. При степени полимеризации n=10 образует кристаллическую решетку. Нитевидные молекулы, взаимодействуя между собой, образуют прочные структуры - фибриллы. В объеме таких фибрилл существуют упорядоченные кристаллические участки, где молекулы рас­положены параллельно друг другу и связаны водородными связями, сущеcтвуют также участки с неупорядоченной структурой - аморфные.

Микроорганизмы способны синтезировать целый комплекс целлюло-литических ферментов, которые последовательно катализируют процесс гидролиза целлюлозы до глюкозы. В ферментном комплексе различают три группы ферментных препаратов: Ci-фактор, Сx-фермент и целлюбиазу.

Целлюлолитические ферментные препараты нашли применение в целлюлозно-бумажной промышленности, медицинской промышленности (получении лекарственных веществ - стероидов из растений), в пищевой про­мышленности (при производстве растительных масел) и в сельском хозяйстве (в качестве добавок к кормам жвачных животных).

По прогнозам ученых, основным потребителем ферментов в ближайшем будущем остается пищевая промышленность. Главное место среди этих энзимов занимают глюкоизомераза и глюкоамилаза, применяющиеся для приготовления обогащенных фруктозой кукурузных сиропов и составляющие около 50 % рынка пищевых энзиматических препаратов.

На коммерческий уровень поставлено ферментативное разделение рацемических смесей аминокислот и эфиров терпенов. Такие смеси образуются при химическом синтезе, и разделение их по оптическим свойствам составляющих имеет важное практическое значение. Известно, что для этого можно использовать традиционные физико-химические и химические методы (хроматография; механическое разделение, избирательное взаимодействие энантиомеров с другими оптически активными веществами), но гораздо более эффективными и удобными оказываются процессы, основанные на стереоспецифичности ферментов. Рассмотрим некоторые из используемых приемов.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: