Получение биомассы дрожжей Культивированием

Получение биомассы дрожжей-сахаромицетов Культивированием на мелассной среде

Биомасса дрожжей является источником белка, витаминов, липидов и других ценных веществ. Примером промышленного производства биомассы микроорганизмов является получение пекарских дрожжей на дрожжерастительных предприятиях.

Продукт «Пекарские дрожжи», производимый в промышленных масштабах, представляет собой биомассу пекарских дрожжей – Saccharomyces cerevisiae, выпускаемыхв виде брикетов влажностью около 75% или сухого порошка влажностью до 10%, используемых в производстве важнейшего пищевого продукта первой необходимости – хлеба. Хлеб обеспечивает организму 18-80 % всех питательных веществ.

Использование дрожжей в хлебопечении основано на их «подъемной силе» (ферментативной активности), образовании аромата и участии в созревании теста, благодаря выделяемому СО₂, который делает хлеб пористым, и при этом внешняя поверхность теста увеличивается в 2-3 раза.

Дрожжевые грибы или дрожжи Saccharomyces cerevisiae по современной номенклатуреотносятся к роду Saccharomyces семейства Saccharomyceaceae порядка Endomycetales (голосумчатые) класса Endomycetes (сумчатые дрожжи) отдела Ascomycota (сумчатые грибы) царства Fungi ( настоящие грибы) [1]. Их объединяют в группу «дрожжи» или низших (несовершенных) грибных организмов, которые в ростовой фазе существуют преимущественно в виде отдельных клеток. Размножаются они чаще всего вегетативным (почкованием) и половым способом (партеногенетически образуют аски и аскоспоры). Эффективно сбраживают сахара в этанол и способны в условиях интенсивной аэрации накапливать биомассу на сахаросодержащих субстратах. Подобные процессы осуществляются в условиях биотехнологического производства.

Производство пекарских дрожжей – сложный микробиологический процесс, конечным итогом которого является накопление биомассы дрожжей Saccaromyces cerevisiae в условиях периодического культивирования с дополнительной подачей (подпиткой) питательной среды. Эффективность дрожжерастильного процесса определяется высоким выходом биомассы (Y) при максимальном коэффициенте усвоения субстрата (концентрация субстрата S):

Y = [X-X_o]/ S

Основным источником углерода (субстрата) в производстве хлебопекарных дрожжей является меласcа – отход производства сахара из сахарной свеклы, основными компонентами которого являются: редуцирующие сахара (до 2%), ди- и трисахариды (10-30% в зависимости от степени очистки мелассы), пектиновые вещества.

Технология дрожжевого производства должна базироваться на точно рассчитанных режимах, начиная с приготовления питательных растворов и заканчивая выпуском готовой продукции. На качество питательной среды, усвояемость ее дрожжами влияют в основном углеродсодержащие, азот- и фосфорсодержащие вещества. Поскольку рост дрожжей ингибируется высокими концентрациями углеводов в питательной среде, то углеводы (мелассу) вводят поэтапно, по мере усвоения углеводов, поддерживая уровень редуцирующих сахаров не более 0,5%. Этот метод культивирования микроорганизмов называется приточным (или периодическим с подпиткой), поскольку питательная среда подается преимущественно непрерывным, умеренно возрастающим потоком.

Другими источниками питания (азота, фосфора, микроэлементов, витаминов) в составе жидкой производственной питательной среды для культивирования сахаромицетов являются аммоний фосфорнокислый однозамещенный, карбамид (мочевина), хлорид калия и биотин (витамин Н).

Цель работы: Изучение процесса накопления микробной биомассы дрожжей-сахаромицетов методом периодического культивирования с подпиткой питательной среды.

Подготовка посевного материала

Клетки дрожжей Saccaromyces cerevisiae представляют собой сферические или овальные клетки, размером (8 –10) мкм, неподвижные, размножаются почкованием, не образуют субстратный мицеллий, не образуют спор, полиплоидные (чаще ди- и тетраплоидные), они крупнее и физиологически активнее, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным технологическим факторам (устойчивы к повышенным концентрациям солей, температуре, спиртов и др.). Оптимальная температура роста и размножения 28-30 ⁰С. Культуры Saccaromyces cerevisiae сохраняют в результате периодических пересевов через 3-6 месяцев на сусле 6^оБ+1,5% агара (сусло-агар).

Для длительного хранения широко используют метод хранения дрожжей под вазелиновым маслом (на 1 год), который позволяет сохранить жизнеспособность в течение 5 лет без пересевов. Дрожжи также можно хранить дрожжи в лиофилизированном состоянии и в 10% растворе сахарозы от 3 до 10 лет.

Для получения маточной культуры (инокулята) готовят жидкую питательную среду (таблица 1). Среду стерилизуют при 0,5 ати и после охлаждения до температуры культивирования засевают суспензией клеток со скошенного агара (1 пробирка на колбу). Для посевного материала культуры выращивают на качалке (150-180 об/мин) в колбах на 250 мл с объемом среды 50 мл при 28-30 ⁰С. Время выращивания инокулята составляет 18-24 ч. Затем производят засев лабораторного ферментера полученным инокулятом. Количество инокулята составляет ~ 2-5 % от объема питательной среды.

Проведение периодического культивирования дрожжей в лабораторном ферментере

Процесс культивирования дрожжей Saccaromyces cerevisiae осуществляют в лабораторном ферментере (рабочий объем 3 л), оснащенным барботером (подача воздуха с помощью микрокомпрессора), встроенным змеевиком, позволяющем поддерживать оптимальную температуру культивирования.

Контроль рН осуществляют с помощью рН-метра, подтитровывая питательную среду с помощью раствора аммиачной воды до рН 4,2 – 5,5, поскольку при снижении рН усиливается сорбция красящих веществ мелассы и пенообразование. В качестве пеногасителя используют производные жирных кислот.Контроль температуры осуществляют с помощью термометра, концентрацию растворенного кислорода – не менее 2 мг/л.Результаты микробиологического контроля состояния дрожжевой культуры заносят в таблицу 2. Контроль за состоянием клеток (подсчет растущих, почкующихся, мертвых клеток и др.) производят в камере Горяева.

Условия культивирования. Начальный объем питательной среды составляет 25-30%, посевной материал – 2-5%, рН – 4,2-5,0; концентрация редуцирующих веществ мелассы – не более 0,5%.Оптимальная удельная скорость роста дрожжей не более 0,2 ч^-1. Содержание этанола поддерживают на уровне 0,1-0,5%. Выращивание дрожжей проводят в условиях интенсивной аэрации на жидкой среде следующего состава (г/л), которая представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Состав питательной среды для выращивания дрожжей

Указания по организации работы. Фосфорсодержащие соли, соли калия и магния задают в начале «складки» (начального объема питательной среды) в воду, перед подачей засевных дрожжей. Поскольку эти компоненты усваиваются дрожжами по мере необходимости, то их избыток не сказывается на режиме выращивания. Дозировка их при «складке» способствует уравниванию осмотического давления в среде в начале цикла выращивания. Общее время лабораторной ферментации составляет 8-12 ч.

Соли азота следует вносить в питательную среду лишь в количествах, необходимых для прироста биомассы дрожжей, поскольку азот используется дрожжами наравне с углеродом для синтеза белка. Такая подача азотсодержащих солей способствует оптимизации удельной скорости роста, наибольшему усвоению субстрата и нормализации pH среды. С учетом этого фактора необходимо до начала занятия по лабораторному культивированию определить химический состав мелассы, содержащей, помимо углеводов также азот и фосфор в усвояемой форме. Во время ферментации контролируют основные параметры процесса, отбирая пробы каждые 1-2 ч, которые заносят в таблицу 2.

Таблица 2 – Контроль параметров культивирования на лабораторном ферментере

Для анализа накопления биомассы дрожжей, содержания РВ, рН пробы отбирать каждый час, для других видов анализа – 1 раз в 2 ч.

На основании расчета удельной скорости роста в течение 1-2 ч культивирования рассчитать потребность в субстрате (в пересчете на мелассу) для осуществления лабораторного культивирования в режиме его дробного внесения и составить график внесения мелассы с учетом разбавления в культуральной среде (таблица 3)

Таблица 3 – Контроль и режим дозирования субстрата

Пользуясь результатами подсчета клеток определяют удельную скорость роста дрожжей по соотношению:

μ= 2,3(lga₂ – lga₁)/ t₂ – t₁,

где а₁, а₂ – количество клеток (в мл) в начале и конце промежутка времени соответственно (t₂ – t₁).

Помимо анализов параметров культивирования и содержания компонентов питательной среды, каждые 2 ч производят оценку состояния культуры продуцента согласно приложению.По окончании культивирования культуральную жидкость отделяют декантацией или сепарацией от биомассы дрожжей. Полученную биомассу дрожжей взвешивают с учетом влажности и собирают в холодильник для выделения ферментов и анализа на фруктофуранидазную (инвертазную) активность. Культуральную жидкость (в зависимости от задания) концентрируют на вакуумном роторном испарителе для анализа на внеклеточную инвертазную активность.

На основании полученных данных делают вывод об эффективности процесса (выход биомассы, коэффициент использования субстрата, продуктивность).

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2

получение биомассы дрожжей Культивированием

НА МЕЛАССНОЙ БАРДЕ

Мелассная барда может служить основой питательной среды для выращивания биомассы дрожжевых организмов в качестве дешевого источника незаменимых аминокислот и витаминов в составе получаемого белкового препарата.

Поскольку состав мелассная барда обеднен источниками азота и фосфора в результате спиртового культивирования дрожжей на мелассе, необходимым условием является внесение усваиваемых форм азота и фосфора в виде солей и минеральных кислот.

Для обеспечения в дрожжах фосфора в пересчете на Р₂О₅ на уровне 3,0 – 3,5% и аммонийного азота 7,0-8,0% (в расчете на сухое вещество), а также с учетом некоторого остатка в культуральной жидкости необходимо внести (г/л барды): диаммонийфосфата 1,0-1,2 ( или ортофосфорной кислоты – 0,9-1,2); суперфосфата (18%-ного) 2,8-3,0%; сульфата аммония 2,0-2,5 %.

Динамика потребления питательных веществ барды зависит от начальной концентрации в ней сухих веществ. При использовании неразбавленной барды (8-9 % сухих веществ) до 82-85 % сухих веществ (СВ) остаются неутилизированными, а при разбавлении барды даже в 2 раза до 75% СВ остаются неиспользованными.

В качестве продуцентов белковой массы используются дрожжевые организмы Сandida guillermondii, Rhodotorula utilis, интенсивно потребляющие карбоновые (уксусную, молочную, янтарную, гликолевую) кислоты.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: