Подготовка посевного материала

Для получения инокулята дрожжей Rhodotorula utilis готовят твердую питательную среду (сусло 6 ^оБ+ 1,5% агара) и пересевают смывом с 1-2 косячков культуры на качалочные колбы объемом 250 мл с 50 мл жидкой питательной среды состава (г/л): барда 10 –30 (или уксуснокислый натрий – 5,0-8,0 ); (NH₄)₂SO₄ – 2,0; (NH₄)₂HPO₄ – 1,8; KCl – 0,5; дрожжевой автолизат – 0,1 (на колбу 1 косячок культуры).

Среду стерилизуют при 0,5 ати и после охлаждения до температуры культивирования засевают суспензией клеток со скошенного агара (1 пробирка на колбу). Для посевного материала культуры выращивают на качалке (150-180 об/мин) в колбах на 250 мл с объемом среды 50 мл при 30-33 ^оС.

Время выращивания инокулята составляет 18-24 ч. Затем производят засев лабораторного ферментера полученным инокулятом. Количество инокулята составляет ~ 2-5 % от объема питательной среды.

Подготовка мелассной ( послеспиртовой) барды

После отделения мертвых клеток спиртовых дрожжей Saccaromyces cerevisiae и шлама фильтрацией, мелассную барду в зависимости от состава разбавляют, подкисляют до рН 4,0-4,5, добавляют питательные соли и используются для выращивания дрожжевых организмов Rhodotorula utilis.

Таблица 1 – Характеристика мелассной барды

Показатели/компоненты	Содержание, %
1 Сухие вещества	8,0 – 9,0
2 Органические сухие вещества	6,0 –7,0
3 Редуцирующие вещества	0,2 –0,3
4 Карбоновые кислоты	1,0 – 1,6
5 Глицерин	0,5 – 0,7
6 Азот общий	0,3 – 0,5

Проведение периодического культивирования дрожжей в лабораторном ферментере

Процесс культивирования дрожжей Rhodotorula utilis осуществляют в лабораторном ферментере (рабочий объем 3 л), оснащенным барботером (подача воздуха с помощью микрокомпрессора), встроенным змеевиком, позволяющем поддерживать оптимальную температуру культивирования.

Контроль рН осуществляют с помощью рН-метра, подтитровывая питательную среду с помощью раствора серной кислоты до рН 4.5-5,0. Оптимальная температура культивирования 28-30^оС, концентрация растворенного кислорода – не менее 2 мг/л.

Содержание сухих веществ определяют ареометром, РВ – методом Шомодьи-Нельсона, карбоновые кислоты – по общей титруемой кислотности.Результаты микробиологического контроля состояния дрожжевой культуры Rhodotorula utilis заносят в таблицу 2. Контроль за состоянием клеток (подсчет растущих, почкующихся, мертвых клеток и др.) производят в камере Горяева (увеличение х40) с использованием светлопольного микроскопа.

Выращивание дрожжей проводят в условиях интенсивной аэрации на жидкой среде следующего состава (г/л), которая представлена в таблице 2.

Таблица 2 – Состав питательной среды для выращивания дрожжей Rhodotorula utilis

Компоненты среды (г/ л) Варианты

I II Ш

1 Мелассная барда (в пересчете на РВ не более 0,1-0,2%)

2 Диаммоний фосфат (в пересчете на Р₂О₅4,7%) 1,2 1,2 1,2

3 Азот в виде солей - Сульфат аммония - Карбамид (мочевина) 0,9 0,7 0,9 0,7 0,9 0,7

4 Калий хлористый 0,5 0,5 0,5

5 Дрожжевой автолизат 0,1 0,1 0,1

В качестве пеногасителя используют производные жирных кислот.

Во время ферментации контролируют основные параметры процесса, отбирая пробы каждые 1-2 ч, которые заносят в таблицу 2. Общее время лабораторной ферментации составляет 8-12 ч.

Для анализа накопления биомассы дрожжей, содержания РВ, рН пробы отбирать каждый час, для других видов анализа – 1 раз в 2 ч.

Таблица 3 – Контроль параметров культивирования на лабораторном ферментере

Время отбора проб, ч Концентрация биомассы рН Контроль параметров (концентрация, мг/л)

Х, ОД₆₀₀ мг АСВ в л клеток в мл Кислород растворен. РВ сухие вещества Азот аммонийный Фосфа- ты

0-….12

На основании расчета удельной скорости роста в течение 1-2 ч культивирования рассчитать потребность в субстрате (в пересчете на мелассную барду) для осуществления лабораторного культивирования в режиме его дробного внесения и составить график внесения барды с учетом разбавления в культуральной среде (таблица 4)

Таблица 4 – Контроль и режим дозирования субстрата

Время культивирования, ч Внесение субстрата (мелассной барды) Текущая концентрация РВ, г/л

объем питательной среды с бардой, мл Концентрация РВ, г/л Содержание сухих веществ

По окончании культивирования культуральную жидкость отделяют декантацией или сепарацией от биомассы дрожжей. Полученную биомассу дрожжей взвешивают с учетом влажности, и на основании полученных данных делают вывод об эффективности процесса (выход биомассы, коэффициент использования субстрата, продуктивность). В полученной биомассе определяют содержание белка по Къельдалю.

Указания к работе. Соли азота следует вносить в питательную среду лишь в количествах, необходимых для прироста биомассы дрожжей, поскольку азот используется дрожжами наравне с углеродом для синтеза белка. Такая подача азотсодержащих солей способствует оптимизации удельной скорости роста, наибольшему усвоению субстрата и нормализации pH среды.

С учетом этого фактора необходимо до начала культивирования по лабораторному культивированию определить химический состав мелассной (послеспиртовой) барды и оценить содержание остаточного азота, фосфора, карбоновых кислот, РВ и сухие вещества барды.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

Получение биомассы дрожжей Культивированием

На пшеничных отрубях

Для производства микробных белковых препаратов в качестве источника углерода могут быть использованы крахмалосодержащие вещества, например, отходы сельскохозяйственных, зерноперерабатывающих производств, в том числе отруби, мука и зерно злаковых культур после помола.

В процессе приготовления субстрата его подвергают ферментативному и/или химическому гидролизу преобразуя его в сусло (раствор, содержащий моносахара и олигосахариды), на котором в дальнейшем будет выращиваться микробная культура. Гидролиз проводится или только одним из методов или чаще всего для получения более высокого содержания сахаров (до 1,5-1,8% РВ) включает оба.

Для осуществления ферментативного гидролиза применяют амилолитические ферментные препараты, используемый при температуре 60-70^оС и низком рН (3-4) (например, амилосубтилин). Затем осуществляется подготовка и стерилизация питательной среды. Или же получение гидролизатов отрубей осуществляется в процессе приготовления и стерилизации питательной среды. Длительность цикла стерилизации (с охлаждением) составляет до 6 ч.

Дрожжевые грибы Endomicopsis fibuliger в отличие отдрожжевых грибов Saccaromyces cerevisiae характеризуются образованием субстратного мицелия при росте на углеводсодержащих средах и относятся к активным продуцентам амилолитических ферментов. Это свойство может быть использовано для получения микробной дрожжевой биомассы как источника белка или белкового продукта при росте на крахмалосодержащих субстратах, как, например, пшеничные отруби.

В случае совместного (смешанного) культивирования дрожжей-сахаромицетов и микроорганизмов-продуцентов амилаз, которые при росте на углеводсодержащих субстратах сами продуцируют комплекс амилолитических ферментов, возможно получение биомассы микроорганизмов без использования препаратов амилаз.

Цель работы: Изучение процесса накопления микробной биомассы смешанной культуры дрожжевых грибов методом периодического глубинного культивирования на основе пшеничных отрубей.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: