Повреждение структур и функций клеток

В качестве иллюстрации явления стресса рассмотрим данные литературы относительно клеток Staphylococcus aureus, Esherichia coli и некоторых др. при действии на них повышенных температур. Клетки s. aureus распределяли в фосфатном буфере и прогревали при 52°С в течение 15 мин. делая высевы на питательный агар: (неселективную среду) и питательный агар + 7,5% :хлорида натрия (селективную среду) (устойчивость к хлористому натрию - одна из характерных особенностей клеток staphylococcus aureus ). Нагревание вызывало потерю устойчивости к хлористому натрию, в результате чего клетки переставали расти на селективной среде (рис .35) Как видно в приведенных данных, количество колоний, которые формировались на селективной среде, уменьшалось, в то время как количество колоний на сложной среде оставалась практически неизменным, что свидетельствовало не о потере способности клеток, а только об изменении их свойств (повреждении). После того как клетки были перенесены в температуру 37°С, начинались процессы репарации, и В течение последующих 4-х ч количество клеток, которые были способны формировать колонии на среде с 7,6% хлористого натрия, постепенно возрастало. К шестому часу количество колоний на селективной и неселективиой средах выравнивалось и бактерии приступали к активному росту. Таким образом, рост на селективной среде возобновлялся только по достижении определенного уровня репарационных процессов. Итак, внешняя картина, свидетельствовшая о повреждении клеток – это отсутствие роста на селективной среде. При этом в клетках происходит ряд структурных и функциональных изменений. Рассмотрим некоторые из них.

Изменение проницаемости цитоплазмотической мембраны. При действии стрессовых агентов происходит изменение проницаемости цитоплазматической мембраны. О наличии повреждений свидетельствует ряд моментов: уже упоминавшаяся повышенная чувствительность к хлористому натрию, выход из клетки компонентов метаболического пула, в состав которого входят низкомолекулярные белки, аминокислоты, сахара, фрагменты коэнзимов, ионы магния, натрия, ортофосфорфорная кислота и др. Так, например, установлено, что в интактных клетках staphylococus содержалось 200 нмоль аргинина, а в клетках, поврежденных теплом всего 9 нмоль. Далее установлено, что при действии повышенных температур клетки теряют материал, поглощающий УФ при длине волны 200 нм (рис.36). Из представленных данных показано, что с увеличением времени инкубации при 52,0°С количество материала стремительно нарастает. Стрессовое воздействие нарушает транспортную функцию мембран. Так, например, ycтановлено, что клетки staphylococcus aureus после 15 мин нагревания поглощают всего 10% аспартата по сравнению с тем, чго способны поглощать клетки контрольного варианта. В литературе описаны и некоторые другие методические приемы, с помощью которых доказывается нарушение проницаемости мембран при стрессе. Так, например, на клетках Escherichia coli показано, что антибиотик тирозин в 5 раз сильнее ингибировал рост прогретых клеток (52,0°С; 5 мин), по сравнению с непрогретыми.

Во время прогревания проницаемость мембран возрастала, что способствовало проникновению антибиотика внутрь клеток. Изменение функции мембран можно до некоторой степени объяснить тем, что при стрессовых воздействиях мембраны теряют входящие в их состав липиды. Так, на клетках Staphylococcus aureus показано, что при нагревании их мембраны теряют около 1/3 всех липидов.

Рибосомальная РНК и рибосомы. Как уже отмечалось, поврежденные клетки теряют материал, поглощающий УФ свет с длиной волны 260 нм, что указывает на присутствие пуриновых, пиримидиновых оснований и их производных. Количе­ство таких соединений значительно превосходит те, которые мо­гут быть обнаружены в пуле неповрежденных клеток. Эти данные свидетельствуют, очевидно, о том, что под влиянием стрессового агента происходит деградация нуклеиновых кислот. Разнообразные и многочисленные эксперименты показали, что материал, поглощающий УФ свет при длине волны 260 нм, представлен продуктами деградации РНК (преимущественно p-РHK), в то время как про­дуктов деградации ДНК не было обнаружено. Исследования последних лет установили, что процесс деградации p-РHK и рибосомы протекает с удивительно высокой скоростью. Так, в отношении рибосом показано, что за 7 дней при 52°С разрушается до 90% 30S и 10% 50S субъединиц рибосом, причем 30S субъединиц рибосом исчезают при тепловой обработке в течение I мин. Наряду с исчезновением 30S субъединиц происходит исчезновение и 16S р-РНК. Деградации 50 S субъединиц и 23 S р-РНК не наблюдается. Вместе с тем вторичная и третичная структуры этих частиц, очевидно, нарушены, так как в системах in vitro 235 р-РНК и 50S субъединицы оказываются неактивными. При накоплении процесса деградации рибосом с потерей клетками жизнеспособности (рис.37) становится очевидным, что по мере нарастания процесса деградации рибосом число жизнеспособных клеток падает. Создается впечатление, что существует тесная корреля­ция между деградацией р-РНК, рибосом и жизнеспособностью клеток. Вместе с тем деградация рибосом и р-РНК имеет место только в тех случаях, когда среда инкубации не обогащена ионами магния. Если клетки прогревать в буфере с 10 моль МgСl₂,.тогда из клеток выходит значительно меньше материала, поглощающего УФ свет. Кроме того, в этих условиях не представляется возможным выявить деградацию рибосом (если судить по характеру седиментации их в градиенте плотности сахарозы). Как видно из рис. 38, характер распределения рибосом в клетках, подвергшихся нагреванию в течение 15 мин при 52°С в присутствии МgСl₂, такой же, как и в клетках, находившихся при температуре 20°С. Однако отсутствие деградации рибосом и р-РНК не устраняло некоторых эффектов стрессора, в частности клетки s. aureus также теряли способность расти в средах с хлористым натрием. Рост в этих условиях возобновлялся только после периода репарации.

К настоящему времени складывается представление о том, что нагревание приводит к нарушению структуры рибосом опосредованно, через потерю клетками ионов магния. Последовательность событий, очевидно, следующая: потеря клетками магния вызывает диссоциацию рибосом и активизирует РНКазы, которые и атакуют клеточную РНК. Следовательно, деградация рибосом - процесс вторичный, обусловленный действием энзимов, и повышение температуры до 52°С само по себе не оказывает влияния на РНК. Специально проведенные опыты показали, что рибосомы, извлеченные из клеток и подвергнутые действию повышенных температур, при которых клетки гибнут, полностью сохраняют свою активность. Пока остается неясным, почему РНК преимущественно разрушается именно 30S субъединиц рибосом.

Повреждение Д Н К. Согласно многочисленным данным при различного рода стрессовых воздействиях (в том числа и тепловом) происходят повреждения ДНК клеток. Повреждения заключаются в появлении разрывов одной или обеих цепей ДНК. Отмечено, что нередко процессы повреждения ДНК и потеря жизнеспособности клетками коррелируют. Имеющиеся данные о действии стрессоров на ДНК свидетельствуют о том, что стрессоры в данном случае индуцируют активность системы ДНКаз, которые и осуществляют разрывы в цепях ДНК. Это положение подтверждается тем, что если например, извлечь из клеток. ДНК и прогреть ее при температурах, при которых клетки теряют жизнеспособность, то разрывов нитей ДНК не наблюдается. Так, прогрев извлеченной из клеток Escherichia coli ДНК при 52⁰ С в течение 15 мин не вызывает разрывов, в то время как в клетках такие разрывы появляются. Таким образом, повреждение ДНК, как и деградация рибосом, является, по-видимому, вторичным явлением. Наряду с этим было показано, что нагревание клеток Escherichia coli (50,0°С в течение 15-60 мин) приводит к изменению структуры нуклеоида. Последнее выражается в том, что константа седимен-тации у нуклеоидов из прогретых клеток возрастает до 3000-45003, в то время как у контрольных клеток этот показатель равен 900S. Полагают, что увеличение константы седиментации вызвано ассоциацией клеточных белков с нуклеодом в результате нагрева.

Поглощение кислорода и активность ферментных систем. В литературе имеются данные о том, что при действии различного рода стрессовых агентов происходят изменения метаболизма клеток микроорганизмов. Так, например, у клеток Staphylococcus aureus падает интенсивность поглощения кислорода после теплового воздействия (табл.). Из материалов, представленных в табл.42, видно, что интенсивность поглощения кислорода клетками, обработанными теплом, во всех случаях ниже, чем у клеток контрольного варианта. Далее показано, что эффективность этого процесса зависит от источника углерода. Очевидно, ферментные системы, принимающие участие в метаболизме разных источников углерода, повреждаются одним и тем же стрессорным агентом в разной степени. Повышенная температура при-водила к уменьшению активности рода дегидрогеназ (в частности, лактат-дегидрогеназы - в 7 раз) и фруктозодифосфатальдолазы(в 2 раза). В то же время активность таких ферментов как глюкозо-6-фосфатдегидогеназа, пируватгеназа и др., оставалась одинаковой как в клетках, подвергшихся тепловому воздействию, так и в интактных клетках. Наряду с этим было отмечено, что активность фосфоглицератгеназы и некоторых других после прогрева клеток S. aureus увеличивалась. При этом, однако, процентное соотношение ЭМП-пути и ПФ-пути в метаболизме нормальных и травмированных клеток S. aureusоставалось одинаковым.

Таблица

Поглощение кислорода интактными и поврежденными клетками Staphylococcus аureus

Значительное влияние стрессорные воздействия оказывают на активность ферментных систем, защищающих клетку от токсичных продуктов: перекись водорода и супероксид-радикала. Показано, что нагревание клеток Staphylococcus аureus в фосфатном буфере при 52°С вызывает снижение активности супероксиддисмутазы до 5, 10, 22 и 67% Это приводит к дополнительному повреждению клеток и снижению их жизнеспособности

Все представленные данные свидетельствуют о том, чтострессовое воздействие в силу своей неспецифичности вызывает повреждение различных структур и функций клетки, и не исключено, что некоторые из этих повреждений явно имеют вторичный характер. Многочисленные попытки установить, какое именно повреждение является решающим для потери клетками способности расти на селективной среде, пока не привели к успеху, очевидно, в силу комплексного эффекта этих повреждений.

Репарация повреждений

После устранения действия стрессора в клетках микроорганизмов начинается репарация имеющихся повреждений. Как правило, этот процесс продолжается в течение нескольких часов. Длительность его определяется природой организма, особенностями имеющихся повреждений, условиями среды, в которой протекает процесс репарации. Так, в отношение Staphylococcus аureus установлено, что после действия такого стрессора, как повышенная температура, репарация продолжается в течение 4-6 ч. Об окончании репарации, как это уже было отмечено, судят по восстановлению способности клеток расти на минимальной и (или,¹ селективной среде.) Репарация - сложный "многогранный" процесс. В литературе неоднократно отмечалось, что процесс репарации может происходить в условиях среды, отличающихся от тех, в которых клетки растут. В лаборатории Харста было показано, что репарация клеток Staphylococcus aureus с высокой эффективностью протекает в дистилированной среде или в среде НК, разбавленной в соотношении 1:10, 1:100. Концентрация питательных веществ в таких средах мала, и рост клеток практически не происходит.

Наряду с этим имеются данные о репарации клеток в средах, содержащих некоторых антибиотики, например пенициллин и т.д.

К настоящему времени нет единого мнения относительно состава питательных сред: должны ли среды быть "бедными" или "богатыми". Вместе с тем твердо установлено, что для процессов репарации ионы магния, фосфора, некоторые аминокислоты имеют принципиальное значение, в то время как витамины, ионы натрия, калия могут не требоваться вовсе. Репарация может протекать при температуре, отличающейся от оптимальной для процессов роста клеток. Так, если для Staphylococcus аureus температура 37°С является оптимальной как для роста, так и для репарации, то для Esherichia coli (оптимальная температура для роста 37°С) репарационные процессы с одинаковой активностью протекают в интервале_температур 20-37°С и прекращаются только при о,5°с.

Все эти разнообразные наблюдения процесса репараций свидетельствуют, очевидно, о том, что в качество критериев трав-мированности клеток микроорганизмов нередко выбирают различные параметры, как биохимические, так и физиологические, поэтому и для репарации могут требоваться зачастую весьма различные условия .

Восстановление функций мембран. Как уже отмечалось, мембраны Staphylococcus аureus теряют при нагревании часть фосфолипидов и липидов. В период репарации происходит восстановление содержания липидной фракции мембран: кооличество разветвленных жирных кислот возвращается до уровня, который имел место в интактных клетках. Что касается;_: насыщенных жирных кислот, то в .течение первых 2-3 ч. репарации наблюдается гиперсинтез этих соединений, а далее, к пятому часу репарации, их количество достигает уровня клеток контрольного варианта. В период репарации восстанавливается также способность клеток восполнять пул утраченных метаболитов. Вместе с тем к концу репарации клеток Staphylococcus аureus отношение К. / Na⁺ оставалось таким же низким, как и у поврежденных клеток. За время репарации не наблюдалось также полного восстановления способности клеток к транспорту аминокислот;: репарированые клетки поглощали всего 37% аспирата по сравнению с клетками контрольного варианта. Очевидно, при стрессовом воздействии повреждается ряд участков на мембране, репарация которых .протекает с разной скоростью, а восстановление солетолерантности (критерий окончания репарации в данных экспериментах) -одно из ранних явлений.

Восстановление функций РНК и рибосом. После устранения действия стрессора в клетках с высокой интенсивностью начинают протекать процессы синтеза 5S, I6S, 3 S р-РНК и рибосом. В отношении Staphylococcus аureus установлено, что р-РНК синтезируется из предшественников, так как в лизатах клеток после действия стрессора обнаруживают вначале I7S РНК вместо 16 S и 24S РНК вместо 23S .Что касается рибосом, то если лизаты клеток контрольного варианта содержали 50S и 30S, субъединицы, то в опытных наряду с 50S и 3.0S субъединицами обнаружены частицы 48S , 3IS , 28 S .

Для изучения роли РНК и рибосом в процессах репарации клеток микроорганизмов после действия на их стрессовых агентов, в ряде случаев использовали ингибиторный анализ. В опытах со Staphylococcus аureus было установлено, что в присутствии актиномицина процесс репарации клеток полностью прекращался. Аналогичные данные были получены с Pseudomonas fluorescence и Vibrio parahaemolytlcus при добавлении в репарационную среду таких ингибиторов синтеза РНК, как рифампицин. В процессе синтеза РНК и рибосом первым этапом, очевидно, является накопление клеткам утраченного при травмировании магния. Только после этого начинается синтез рибосмальной РНК и образование активных рибосом. Нередко время, необходимое для синтеза РНК и рибосом, совпадает с продолжительностью лаг-периода, предшествующего активному росту клеток.

Все эти данные свидетельствуют, очевидно, о том, что для репарации клеток микроорганизмам необходимо восстановить уровень РНК и рибосом, поврежденных стрессовым воздействием.

Репарация ДНК. В период восстановления функций клеток происходит и репарация разрывов в цепях ДНК. Штаммы микроорганизмов, дефектные по лигазе, не способны к росту после стрессового воздействия. Как уже было отмечено, при репарации ДНК после стрессового воздействия большое значение имеет состав питательной среды, в которой инкубируют поврежденные клетки. Так, на клетках Salmonella typhi было показано, что если бактерии после стрессового воздействия переносили в питательный бульон, то количество клеток, способных формировать колонии на селективной среде, составляло 7,0 х 10⁶/мл. В тех случаях, когда клетки переносили в среды, обедненные питательными веществами, число клеток, способных формировать колонии, было почти на два порядка выше (16 х 10⁸/мл). Состав питательной среды для репарации микроорганизмов после стрессового воздействия приобретает особенно большое значение в тех случаях, когда этот процесс протекает в присутствии ингибиторов синтеза ДНК, в частности налидиксовой кислоты.

В опытах с Vibrio parahaemolvticue было установлено, что наличие ингибитора в питательном булъоне предотвращает репарацию клеток, поврежденных теплом. Однако в глюкозо-минеральной среде наличие ингибитора синтеза ДНК не оказывало влияния на эффективность репарации бактерий, продолжительность этого процесса с ингибитором и без него была одинаковой.

Создается впечатлений, что ДНК-азы активизируются только на богатых средах и осуществляют разрывы в цепях ДНК на участках, где находятся уже поврежденные каким-либо стрессором основания .

Ранее были приведены данные об изменении профиля седиментации в градиенте плотности сахарозы нуклеоидов, полученных из клеток Esherichia coli, претерпевших действие повышенной температуры. Наблюдение за "поведением" нуклеоидов показали, что в процессе репарации клеток происходит восстановление первоначального профиля седиментации и к четвертому часу он становится неотличим от такового у интактных клеток. К этому же времени полностью восстанавливается способность клеток к росту.

Все приведенные данные свидетельствуют о том, что в разных опытах (разные микроорганизмы, разные условия постановки экспериментов и т.п.) получены достаточно противоречивые ответы и до настоящего времени нет единого мнения относительно участия ДНК в процессах репарации.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: