Определение активности ферментов.

Регуляция активности ферментов путем белково-белковых взаимодействий.

Возможны два механизма регуляции активности ферментов таким путем.

1. Регуляция в результате присоединения регуляторных белков. Можно рассмотреть на примере фермента аденилатциклазы, локализованного в плазматической мембране клетки. Этот фермент катализирует реакцию образования цАМФ из АТФ. Активный центр фермента расположен с цитоплазматической стороны мембраны, а сигналом, для начала синтеза является присоединение гормона (адреналина, глюкагона) к рецепторному белку на наружной внеклеточной стороне мембраны. Промежуточным звеном в передаче гормонального сигнала служит G-белок (ГТФ-связывающий белок). После присоединения гормона к рецептору G-белок меняет свою конформацию, связывает ГТФ, диссоциирует на две части и один из протомеров связывается с аденилатциклазой, активируя её. В этой системе G-белок выполняет регуляторную функцию.

2. Регуляция активности ферментов путем ассоциации/диссоциации субъединиц. Можно рассмотреть на примере фермента протеинкиназы. Этот фермент катализирует реакцию переноса остатка фосфорной кислоты с АТФ на ОН-группы белков-ферментов. Молекула протеинкиназы состоит из 4-х протомеров (субъединиц) 2-х типов: 2 – регуляторных (R) и 2- каталитических (C). Каталитические субъединицы содержат активные центры, а регуляторные – по два центра связывания цАМФ. После присоединения к молекуле протеинкиназы 4-х молекул цАМФ, конформация фермента меняется и он диссоциирует на регуляторный димер и две активные каталитические субъединицы.

Отсоединение цАМФ от регуляторных субъединиц приводит к ассоциации комплекса с потерей его активности.

Регуляция ферментативной активности путем ковалентной модификации.

Два механизма.

Фосфорилирование/дефосфорилирование. Это быстрый и широкораспространенный способ регуляции активности ферментов. Фосфорилированию подвергаются ОН-группы аминокислотных остатков ферментов. Фосфорилирование осуществляется ферментами протеинкиназами, а дефосфорилирование – фосфатазами. Присоединение фосфорной кислоты к молекуле фермента приводит к изменению конформации активного центра и изменению его активности. При этом, в зависимости от фермента, активность может возрастать, а может – уменьшаться. Дефосфорилирование вызывает противоположный эффект.

Активность протеинкиназ и фосфатаз контролируется гормонами, что позволяет быстро изменять активность ключевых ферментов метаболических процессов в зависимости от условий в организме. Например, в период между приемами пищи в клетках печени под действием глюкагона запускается процесс фосфорилирования ряда ферментов, ответственных за запасание и использование резервных энергетических субстратов – гликогена и триацилглицеролов. При этом ферменты, участвующие в распаде (мобилизации) этих соединений – гликогенфосфорилаза и липаза переходят в активное состояние, а ферменты, участвующие в синтезе – гликогенсинтаза - в неактивное. Во время пищеварения, под действием инсулина, наоборот, активируются процессы синтеза гликогена и резервных жиров и тормозится их распад, т.к. инсулин запускает процесс дефосфорилирования тех же ферментов. Т.О. в клетке, в данный момент времени может идти или только процесс синтеза гликогена или его мобилизация.

2. Частичный протеолиз. Некоторые ферменты, функционирующие вне клеток (в желудочно-кишечном тракте или в плазме крови), синтезируются в виде неактивных предшественников – проферментов или зимогенов. Их активация происходит путем разрыва одной или нескольких пептидных связей и отщепления части белковой молекулы. В результате в оставшейся части белковой молекулы происходит конформационная перестройка и формируется активный центр фермента.

Рассмотрим механизм частичного протеолиза на примере активации протеолитического фермента трипсина. Его предшественник – трипсиноген, синтезируется в поджелудочной железе и поступает при пищеварении по протокам поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку. В просвете кишки трипсиноген подвергается частичному протеолизу под действием фермента кишечного сока – энтеропептидазы. В результате отщепления гексапептида с N-конца формируется активный центр в оставшейся части пептида. Образовавшиеся молекулы трипсина, обладают аутокаталитической активностью (т.е. способны вызывать частичный протеолиз трипсиногена) и запускают в кишечнике каскад активации всех протеолитических проферментов поступающих туда из поджелудочной железы (химотрипсиноген, проэлластаза, проколлагеназа).

В желудке путем частичного протеолиза под действием соляной кислоты и аутокаталитически происходит активация пепсиногена с образованием пепсина.

В плазме крови частичный протеолиз запускает каскад активации ферментов свертывания крови, (например, протромбин – тромбин, фибриноген – фибрин) приводящий к образованию сгустка.

Значение существования проферментов:

· Защита клетки, в которой вырабатывается фермент от его разрушающего действия

· Возможность накопления ферментов

· Возможность быстрой активации в нужный момент

Структурно-функциональная организация ферментов.

Изоферменты. Ферменты, катализирующие одну и туже химическую реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белка называют изоферментами или изоэнзимами. Другими словами, изоферменты это множественные формы одного фермента. Катализируя одну и ту же реакцию, изоферменты отличаются физико-химическими свойствами (молекулярной массой, электрофоретической подвижностью), кинетическими характеристиками (сродством к субстрату), особенностями активации.

Рассмотрим особенности функционирования изоферментов на примере лактатдегидрогеназы (ЛДГ). ЛДГ катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты), коферментом служит молекула НАД.

СООН СООН

НС–ОН + НАД⁺ С=О + НАДН+Н⁺

-

СН₃ СН₃

Лактат пируват

ЛДГ – олигомерный белок (имеет четвертичную структуру), состоящий из 4-х субъединиц 2-х типов: М (от англ. muscle) и Н (от англ. heart). Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования 5 изоформ ЛДГ.

ЛДГ и ЛДГ наиболее активны в сердечной мышце, ЛДГ и ЛДГ в скелетных мышцах и печени.

В основе существования изоферментов лежат структурные различия кодирующих их генов. Появление в эволюции различных форм ЛДГ обусловлено особенностями окислительного метаболизма тканей. М-типы ЛДГ работают эффективно в анаэробных условиях, Н- типы – в аэробных, когда образующийся пируват далее быстро окисляется до углекислого газа и воды.

Тканевая специфичность изоформ ЛДГ позволяет использовать определение их активности в крови для диагностики ряда заболеваний. Общая активность ЛДГ крови повышается при острых поражениях сердца, печени, почек, мышц, что связано с разрушением клеток этих органов и тканей и выходом ферментов в кровь. Для уточнения диагноза необходимо определить какая из изоформ преобладает в крови. Это возможно определить методом электрофореза, так как Н-формы обладают большим отрицательным зарядом и соответсвенно большей подвижностью в электрическом поле. Увеличение в крови количества ЛДГ и ЛДГ свидетельствует об инфаркте миокарда.

Кроме ЛДГ несколькими изоферментными формами представлены такие ферменты как креатинкиназа, гексокиназа, пируваткиназа и др.

Мультиферменты.

Мультифермент или мультиэнзим это структурно-функциональный комплекс из нескольких ферментов, катализирующих последовательное превращение одного субстрата. Рассмотрим строение мультифермента на примере пируватдегидрогеназного комплекса. Эта мультиферментная система локализована в митохондриях клеток и катализирует необратимую реакцию окислительного декарбоксилирования пирувата. Суммарное уравнение реакции:

СН₃ СН₃

½ Е₁; Е₂;; Е₃ ½

С=О + НАД⁺ + КоА-SН С=О + СО₂ + НАДН+Н⁺

½ . ½

СООН S-КоА

Пируват Ацетил-КоА

В объединенном процессе дегидрирования и декарбоксилирования пирувата участвуют 3 фермента:

Е-1 Пируватдегидрогеназа

Е-2 Дигидролипоил-ацетилтрансфераза (трансацилаза)

Е-3 Дигидролипоилдегидрогеназа

И 5 коферментов : ТДФ (сод. Вит В , липоевая кислота, HS-КоА (пантотеновая кислота), НАД (РР), ФАД (В ).

В центре комплекса находится «ядро» образованное 24 субъединицами трансацилазы, в каждой из которых в активном центре находятся два остатка липоевой кислоты, ковалентно присоединенные к остаткам лизина. Вокруг ядра располагаются крупные субъединицы пируватдегидрогеназы с прочно связанным коферментом ТДФ и дигидролипоилдегидрогеназы с коферментом ФАД. Липоевая кислота в составе центрального фермента выполняет функцию поворотного кронштейна, переносящего промежуточные продукты с фермента на фермент и функционально объединяющего их. В состав комплекса входят также молекулы диссоциирующих непрочно связанных коферментов НАД и HS-КоА, выполняющих функции акцепторов конечных продуктов реакции – отщепляемых атомов водорода и ацетила - остатка уксусной кислоты. Особенность функционирования мультифермента заключается в том, что промежуточные продукты реакции не попадают в окружающую фермент среду.

Объединение набора ферментов, катализирующих многоступенчатую последовательность реакций в макромолекулярный комплекс позволяет:

– четко координировать работу ферментов

– задавать направление потока промежуточных метаболитов

– ускорять метаболический процесс

– эффективно регулировать процесс за счет межферментных взаимодействий.

Регуляторным ферментом комплекса, катализирующим лимитирующую стадию процесса является Е-1 пируватдегидрогеназа. Активность этого фермента регулируется по двум механизмам.

1. Аллостерическая регуляция. Ингибиторами комплекса являются НАДН и ацетил-КоА – конечные продукты реакции.

2. Ковалентная модификация. В присутствии АТФ активность комплекса резко снижается. Это связано с тем, что АТФ активирует фермент киназу, который использует АТФ для фосфорилирования остатка серина в активном центре пируватдегидрогеназы, в результате чего образуется неактивная форма фермента. При снижении уровня АТФ активируется другой фермент – фосфатаза, который отщепляет от пируватдегидрогеназы фосфат и восстанавливает активность фермента. И киназа и фосфатаза также входят в состав мультиферментного комплекса, который представляет собой саморегулирующуюся систему.

Если упростить вопрос регуляции активности мультиферментного комплекса пируватдегидрогеназа, то можно сказать что его активность регулируется двумя соотношениями: АТФ/АДФ и НАДН/НАД. Увеличение этих соотношений приводит к подавлению активности комплекса, а уменьшение – к активации.

Применение ферментов в медицине.

Ферментные препараты широко используются в медицине по двум основным направлениям – в энзимодиагностике и энзимотерапии.

Энзимодиагностика – постановка диагнозана основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. При многих заболеваниях происходит повреждение клеток и их содержимое, в том числе ферменты, высвобождаются в кровь или из-за нарушения проницаемости мембран клеток (при воспалительных процессах) или за счет нарушения целостности клеток (при некрозе). Уровень активности ферментов в крови коррелирует со степенью повреждения клеток. Примерами ферментов, определение активности которых в крови используется для диагностики состояния разных органов является ЛДГ, АСТ, АЛТ, КФК и др.

Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лекарственных препаратов:

– заместительная терапия при заболеваниях связанных с недостаточностью секретирования пищеварительных соков (фестал, энзистал, мезим)

– комплексная терапия – использование ферментов в качестве дополнительных терапевтических средств. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют при лечении гнойных ран, при тромбозах используют препараты фибринолизина, урокиназы. Фермент гиалуронидазу (лидазу) используют для рассасывания рубцов после ожогов и операций.

При использовании ферментов в медицине следует упомянуть такую форму их применения, как иммобилизованные ферменты. Это ферменты ковалентно закрепленные на полимерной основе. Такие ферменты имеют ряд преимуществ:

– дополнительные ковалентные связи делают их более устойчивыми к действию повреждающих факторов (температуры, протеолитических ферментов)

– можно обеспечить высокую локальную концентрацию в зоне применения

– за счет подбора носителя можно добиться избирательности действия.

Например, упоминавшийся уже фермент урокиназа, используемый для лечении тромбозов, фиксируется на фибриногене, который обеспечивает высокое сродство препарата к формирующимся сгусткам.

Определение активности ферментов.

Измерение ферментативной активности основывается на сравнении скорости химической реакции в присутствии активного биокатализатора со скоростью реакции в контрольном растворе, в котором фермент отсутствует или инактивирован.

Для того чтобы определить скорость ферментативной реакции, необходимо знать: 1) разность концентраций субстрата или продукта реакции до и после инкубации; 2) время инкубации; 3) количество материала, взятое для анализа и его разведение.

Активность фермента рассчитывается по формуле:

, где

а – активность фермента (общая);

DС – разность концентраций субстрата до и после инкубации;

В – количество материала, взятого на анализ;

t - время инкубации;

n - разведение.

За единицу общей активности фермента принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль (10 ^–6 моль) субстрата в единицу времени (1 мин, 1 час) в расчёте на количество материала, взятого для исследования.

За единицу удельной активности принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в единицу времени в расчёте на 1 мг белка пробы.

Удельную активность определяют в том случае, когда нужно сопоставить активность разных препаратов одного и того же фермента. Если требуется сравнить активность разных ферментов, рассчитывают молекулярную активность.

Молекулярная активность (или число оборотов фермента) – это количество моль субстрата, подвергающееся превращению под действием 1 моль фермента в единицу времени (обычно в 1 минуту).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: