Диализ и электродиализ БАВ.

Способы очистки биологически активных веществ (БАВ) растительного, животного происхождения, полученных на основе биосинтеза.

На стадии очистки извлечения культуральные жидкости подвергают последовательной обработке, целью которой является выделение комплекса действующих веществ в нативном состоянии или индивидуальных БАВ, свободных от сопутствующих веществ.

Приемы и способы очистки БАВ весьма разнообразны и индивидуальны. Необходимость применения конкретного метода зависит от начальных свойств извлечения или культуральной жидкости (вязкости, концентрации продукта, наличия примесей и нежелательных нерастворимых веществ), а также от требуемой степени чистоты и конечной формы продукта (кристаллическое вещество, его концентрированный раствор, высушенный порошок и т. д.). Неочищенный продукт можно выделить, например, путем упаривания извлечения или культуральной жидкости после экстрагирования.

Последовательность стадий очистки при получении высокоочищенных БАВ выглядит следующим образом:

1. Отделение нерастворимых веществ. Для этой цели обычно используют фильтрование, центрифугирование, отстаивание, седиментацию и декантацию.

2. Очистка БАВ. На стадии очистки БАВ обычно происходит отделение примесей, а также дальнейшее концентрирование продукта. В этом случае чаще всего используют фракционное осаждение, экстракцию в системах жидкость—жидкость, разделение с помощью мембран, различные сорбционнохроматографические методы.

3. Окончательная очистка БАВ. В рамках такой технологии обычно применяют центрифугирование, кристаллизацию, сушку распылением, лиофилизацией (вымораживанием) или отгонку органического растворителя.

Методы осаждения БАВ из растворов.

Осаждение белков, камедей, слизей, пектинов из водных растворов основано на изменении их растворимости при добавлении значительных количеств определенных веществ. Так, при добавлении в вытяжку раствора электролита, образующиеся ионы электролита гидратируются, обезвоживая молекулы биополимера. При этом исчезает защитный гидратный слой _м0лекул, наблюдается слипание частиц и осаждение биополимера.
Высаливание очень широко применяется для очистки белковых гормонов (гипофиза, поджелудочной, щитовидной и паращитовядных желез), стероидных гормонов, ферментов слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы, продуктов биосинтеза, простагландинов (ПГЕ^ из плазмы крови человека.

Необходимо учитывать и тот факт, что различные соли обладают разными высаливающими свойствами. Еще в 1389 г. Гофмейстер отметил, что наиболее эффективно белки осаждаются в присутствии солей с многозарядными анионами и катионами.
Ряды ионов Гофмейстера (или лиотропные ряды), в которых ионы расположены примерно в порядке уменьшения высаливающей способности, выглядят следующим образом:

Анионы: цитрат, тартрат, Р”, Н₂РО/, СН₃СОО”, Br0₃~, CJ~, СЮ,”, Br”, NO3-, С10₄“, CNS”.

Катионы: Th⁴⁺, Al^s+, Н\ Ва²⁺, Sr²⁺, Са²⁺, Mg²\ СГ, Pb^f, NH’⁾⁺, К⁺, Na^f, Li⁺.

Для осаждения высокомолекулярных соединений чаще всего применяют хорошо растворимые в водных средах аммония сульфат и натрия хлорид, хотя ряды Гофмейстера показывают, что для этих целей можно использовать и другие соли.

Известно применение для осаждения БАВ и флотоагентов (толуол), жидких (парафин и др.). Среди реагентов, способных специфически связывать и осаждать, например ферменты, значительную роль играют растворимые синтетические или природные полимеры и поли электролиты. При получении ферментов, в частности гидролаз, из культуральных жидкостей рекомендовано использовать танин и белковые добавки — желатин, казеин, сыворотку, пектон или желатозу с добавлением танина.

Осаждение биополимеров.

Осаждение биополимеров осуществляют и органическими растворителями (спирт, ацетон), проводимое при охлаждении — один из распространенных способов концентрирования растворов, содержащих белки, слизи, пектины.

Он имеет ряд преимуществ перед высаливанием, в частности возможность регенерации, что положительно сказывается на экономических показателях технологического процесса. Однако органические растворители не обладают способностью осаждения белков и других биополимеров.

При выборе конкретного метода осаждения необходимо учитывать не только степень обогащения и затраты на осаждение, но и требуемую степень чистоты биополимера.

Известно, что осаждение белка зависит от ряда факторов, влияющих на их растворимость, в основном от величины рН, и концентрации раствора. Наименьшая растворимость наблюдается при рН, равном pi, величине, специфической для каждого индивидуального белка. Так как при pi результирующий эаряд молекулы белка равен нулю, а при иных значениях рН молекулы белка имеют тот или иной заряд, то силы электростатическо отталкивания между молекулами растворенного вещест минимальны при pi. Такой механизм предполагает возможное разделения белков с различными изоэлектрическими точкам путем фракционного осаждения; при данном рН будут осаждаться белки, pi которых наиболее близко этому рН (если други характеристики белков, например молекулярная масса, близки).

Путем изменения рН сложную смесь белков разделяют на фракции, содержащие различные белки.

В то же время многие белки при слишком высоких или слишком низких значениях рН могут денатурироваться. По это причине чаще всего применяют другой метод осаждения - высаливание.

Разделение БАВ с помощью мембран.

В настоящее время в химико-фармацевтической и микробиологической промышленности все более широко получают сложные термически и химически лабильные органические соединения. Требуются «мягкие» условия производства, которым в значительной степени отвечают мембранные процессы. Внедрение мембранных процессов позволяет интенсифицировать технологию концентрирования биологически активных веществ, сокращая при этом потери их активности. Мембранные методы разделения смесей, содержащих биополимеры, значительно повышают качество продукции.

Основой разработки современных экономических мембранных процессов явилось получение и последующее усовершенствование высокоселективных ацетатцеллюлозных и синтетических мембран. Так, за последние 20 лет, прошедших со времени получения мембран из ацетата целлюлозы, их проницаемость удалось увеличить приблизительно в 100 раз.

В странах СНГ получили распространение ацетатцеллюлозные мембраны «Владипор», «Мифил» и синтетические полупроницаемые мембраны — из сополимера винилпирролидона с метилметакрилатом.

За рубежом широко применяют мембраны фирм «Абкор», «Миллипор» (США), «Шляйхер Шуель», «Сарториус» (Германия), «Амикон» (Голландия), «Нуклеопор» (Великобритания), комплексные системы ДДС-РО (Дания) для ультрафильтрации и концентрирования (обратный осмос), изготовленные на основе нейлона, поливинилхлорида, тефлона, ацетата нитроцеллюлозы.

Оки имеют высокую пористость (84%), химически стойкие и биологически нейтральные.

В настоящее время разрабатываются установки периодического и непрерывного действия с использованием аппаратов плоскорамного, рулонного, трубчатого типов, а также с применением полых волокон. Также расширяется промышленное производство мембранных фильтров с возможностью выделения достаточно малых частиц: 10—0,2 мкм — при микрофильтрации; 0,02—0,001 мкм — при ультрафильтрации; до 0,0001 мкм ч- при гиперфильтрации (обратный осмос).

Все мембранные фильтры должны работать в условиях широкого интервала температур (0—60 °С), рН (3,0—11,0). При проведении мембранной фильтрации необходимо учитывать градиент электрического потенциала, концентрацию или давление.

Среди жидкофазных мембранных процессов различают диализ, электродиализ, ультрафильтрацию, обратный осмос.

Диализ и электродиализ БАВ.

Явления диализа и электродиализа находят применение при очистке растительных вытяжек. Диализ основан на свойствах молекул биополимеров, имеющих большие размеры, не проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как вещества с меньшими размерами молекул проходят через них довольно свободно. Для диализа используют пленки желатина, целлофана, коллодия, нитроцеллюлозы. Процесс диализа протекает обычно довольно медленно, он ускоряется при повышении температуры, увеличении площади диализа и приложении электрического тока. В последнем случае наблюдаетсяявление электродиализа, которому подвержены в основном вещества, распадающиеся на ионы.

Простейшая установка для. электродиализа состоит из ванны, разделенной двумя полупроницаемыми перегородками на три отсека. В крайние отсеки опущены катод и анод, в средний отсек наливается диализуемая вытяжка. Катионы под действием электрического тока двигаются через полупроницаемые перегородки к аноду, анионы — к катоду. В среднем отсеке остаются вещества, которые не проходят через полупроницаемые перегородки. В процессе работы периодически или непрерывно производится отвод вытяжки, растворов продиализованного вещества.

Электродиализ с ионообменными мембранами до настоящего времени не нашел широкого применения. Имеются лишь исследования, доказывающие возможность очистки технических полупродуктов, содержащих алкалоиды гиосциамин и сальсолин от высокомолекулярных неионизированных веществ методом электродиализа с гетерогенными мембранами МК-40 и гомогенными мембранами МК-1СС.

Исследования также показали, что происходящее в процессе электродиализа превращение катионитовых мембран в форме органического иона сопровождается сжатием ионообменныа частиц гетерогенных мембран, нарушением их связи с ненабухшей основой мембран и равномерным сжатием всей гомогенной мембраны. В первом случае это приводит к микродеструкции мембраны и к значительному увеличению переноса растворителя вместе с недиссоциированными соединениями, что ограничивав возможности очистки. В случае применения гомогенных мембран микродеструкции при переходе в форму органического иона не происходит, поэтому гомогенные мембраны более перспективный для применения в процессе разделения природных полярных и неполярных органических веществ.

Ультрафильтрация БАВ.

Метод ультрафильтрации заключается в разделении высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений на селективных мембранах, способных пропускать низкомолекулярные соединения под действием давления 1—5 кг/см². Ультрафильтрация в 50— 20 раз эффективнее гель-фильтрации и в 1000 раз эффективнее очистки с использованием фракционирования этанолом. Применение ультрафильтрации имеет еще ряд преимуществ: исключается денатурация белка, так как процесс идет без фазовых превращений при любой температуре; возможны одновременное концентрирование и очистка от минеральных и низкомолекулярных органических веществ; незначительные затраты энергии.
Ультрафильтрационные установки отличаются простой конструкцией и эксплуатацией.

Недостатком ультрафильтрации является эмпирический подход к подбору мембран на определенной стадии выделения БАВ. Теоретически предсказать ультрафильтрационные свойства растворов сложного состава невозможно, так как мембраны обычно стандартизируют кислыми веществами с определенной молекулярной массой. В нашей стране выпускают ультрафильтрационные ацетатцеллюлозные мембраны: УАМ 50м, УАМ 100м, УАМ 150м, УАМ 200м, УАМ 300м, УАМ 500м.

Технология ультрафильтрации следующая: суспензию под давлением пропускают через полупроницаемую мембрану с большим количеством пор мельчайшего диаметра (0,02— 0,001 мкм), в результате чего коллоидные частицы задерживаются мембраной, а вода и содержащиеся в ней молекулы проходят сквозь стенки нитей и скапливаются в корпусе патрона. Даже при низком давлении обеспечивается интенсивный поток фильтрата. Активная часть мембраны — это поверхность, по которой проходит суспензия. Разделение фракций происходит именно на этой тонкой поверхности. Мембрана неоднородна по толщине, вследствие чего противление течению жидкости по всей ее поверхности минимально.

Основные производители ультрафильтрационных установок — фирмы «Альфа-Лаваль» (Швеция), «Миллипор» (США), ДДС-РО /Дания), «Амикон» (Нидерланды), АИ-ОУВ, АИ-ОУП, УЛС-3, уКТ-40, УКФ-80 (Россия).

Обратный осмос.

Обратный осмос (гиперфильтрация) — переход растворителя (воды) из раствора через полупроницаемую мембрану под действием внешнего давления. Избыточное рабочее давление раствора в этом случае намного больше осмотического. Движущей силой обратного осмоса является разность давлений: Р = Р _р-ра – Р _ос

Для разделения веществ применяют мембраны двух типов:

1. Пористые с размером пор Ю^-4—10 ³ мкм (1 —10 Е). Селективная проницаемость основана на адсорбции молекул воды поверхностью мембраны и ее порами. В нашей стране выпускают ацетатцеллюлозные мембраны: УАМ-50м, УАМ-500м.

2. Непористые диффузионные мембраныобразуют водородные связи молекулами воды на поверхности контакта. Под действием избыточного давления эти связи разрушаются, молекулы воды диффундируют в противоположную сторону мембраны, а на образовавшиеся свободные места проникают следующие. Таким образом, вода как бы растворяется на поверхности и диффундирует внутрь слоя мембраны. Почти все БАВ, кроме газов, не могут проникать через такую мембрану. В нашей стране и странах СНГ выпускают гиперфильтрационные ацетатцеллюлозные мембраны МГА-80, МГА-90, МГА-100. Цифра в марке означает процент селективности (5):

S=(C1-C2/C1)*100%

где Cj и С₂ — концентрация веществ в исходном растворе и фильтрате, мг/мл.

На этом принципе работают промышленные отечественные установки типа «Роса», УГ-1, УГ-10, производительностью соответственно от 0,1 до 1 и от 1 до 10 м³/сут, и зарубежные фирмы «Абкор» (США), ДДС-РО (Дания). Обычно установки обратного осмоса предназначены для однородных высоковязких жидкостей, выпускают установки двух типов; трубчатые и рулонные, применяя не менее пяти марок фильтрующего материала, обладающих высокой стойкостью к рН (1—13), селективностью и рабочей температурой до 80 °С.

Сорбция.

Методы очистки БАВ сорбцией в настоящее время нашли широкое применение в химико-фармацевтической и микробиологической промышленности.

Сорбцией называют процесс поглощения газов, паров растворенных веществ твердыми и жидкими сорбентами Различают несколько видов сорбции.

Адсорбция — поглощение вещества на поверхности сорбента. Поверхность сорбента обычно очень велика, так как на ней имеете; огромное количество пор. Так, поверхность 1 г активированного угля имеет площадь, равную 600—1000 м². Процесс адсорбци: имеет селективность и позволяет адсорбировать определенные БАВ из раствора.

Абсорбция — поглощение вещества всем объемом твердой или жидкой фазы. Абсорбцию используют, например, при получении эфирных масел. При получении эфирных масел анфлеражем цветы помещают в закрытый сосуд над жиром, который всей своей массой абсорбирует эфирное масло.

Хемосорбция — поглощение веществ с образованием химических соединений. К хемосорбции относятся ионный обмен,аффинная и гидрофобная хроматография. В производстве БАВ растительного и животного происхождения и на основе биосинтеза в основном используют адсорбцию.

Сорбционные процессы.

Сорбционный процесс выделения веществ из раствора смеси веществ представляет собой единство процессов сорбции и десорбции. Процесс десорбции разделен на два этапа: собственно десорбцию, т. е. получение элюата, содержащего целевой продукт, и регенерацию, т. е. удаление из сорбента всех сорбировавшихся веществ, позволяющих вернуть сорбент вновь на стадию адсорбции.

Рациональный выбор адсорбентов, растворителей и условий их применения для получения веществ из растворов должен базироваться на следующих положениях.

1. Адсорбент и условия адсорбции должны быть выбраны так, чтобы они обеспечивали преимущественную и максимальную сорбцию извлекаемого вещества и его минимальную остаточнуюконцентрацию в растворе в условиях равновесия.

2. Десорбирующий растворитель и условия десорбции должен быть выбран так, чтобы в условиях равновесия элюат с относительно высокой концентрацией вещества находился бы в равновесии с адсорбентом с малым содержанием вещества, т. е. чтобы адсорбция из десорбирующего растворителя была бы минимальной.

Следует отметить, что оба эти условия неотделимы друг от друга и. следовательно, выбранный адсорбент должен обеспечивать _}1х выполнение.

В случае сорбции на молекулярных сорбентах осуществление _первых двух условий ведения адсорбционных процессов при выделении веществ из растворов сводится к подбору адсорбента и условий его использования, которые обеспечили бы резкое различие в адсорбционных потенциалах из водного раствора и десорбирующего растворителя.

При подборе таких условий можно исходить из теории Цоляни. По отношению к растворам адсорбционный потенциал растворенных веществ в данном случае выражается уравнением:

Согласно Поляни адсорбированный объем сорбента всегда полностью заполнен адсорбируемым веществом и растворителем. При адсорбции растворенного вещества оно вытесняет из адсорбционного объема часть растворителя. Поэтому чем больше адсорб-
ционный потенциал растворителя, тем меньше величина сорбции растворенного вещества.

При выборе молекулярного сорбента для целей выделения веществ из растворов важную роль играет так называемое правило«уравнивания» полярностей, установленное Ребиндером. Согласно этому правилу адсорбция неполярных веществ на неполярных поверхностях будет успешно происходить из полярных растворителей, адсорбция полярных веществ на полярных адсорбентах — из неполярных растворителей.

В качестве адсорбентов в технологии лекарств применяют пористые твердые вещества с большой удельной поверхностью, наиболее распространенными являются: алюминия оксид, силикагель (гель кислоты кремниевой), уголь активированный, кизельгур, полиамиды, полиакриламиды, сефадексы, целлюлозы и др.

Адсорбцию проводят в специальных аппаратах — адсорберах, простейшим из них является вертикальный цилиндрический аппарат периодического действия, заполненный адсорбентом. Вначале через адсорбент пропускают раствор и насыщают его поглощающим веществом, затем фильтруют десорбентрастворитель или смесь растворителей, вытесняющую поглощенное вещество.

Для проведения непрерывной адсорбции применяют установки из нескольких адсорберов периодического действия, в которых попеременно происходят адсорбция и десорбция.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: