Современные теории и представления

СОДЕРЖАНИЕ

Вступление

История изучения образования кислот грибами

Современные теории и представления

Заключение и выводы

Литература

ВСТУПЛЕНИЕ

Во второй половине XIX века начали поступать первые сообщения о продуцировании грибами органических кислот. 1877 год, Гамлет и Пловрит устанавливают способность грибов к биосинтезу щавелевой кислоты. Примерно в тоже время Генрих Антон Де Бари немецкий ботаник и миколог, (из отцов-основателей микологии) отмечает явление формирования кристаллов оксалатов кальция у грибов, как и его повсеместное проявление. 1891 год, ещё один немецкий учёный - Карл Вамер устанавливает образование щавелевой кислоты Aspergillus niger, но продуцирование лимонной кислоты данным видом остаётся им незамеченным. 1893 год, Вамер демонстрирует образование лимонной кислоты Penicillium – подобными плесневыми грибами и даже предлагает выделить их в отдельный род Citromyces (что позднее был объединён с Penicillium Чарльзом Томом).

С этих трудов и начинается изучение продуцирования кислот грибами. Сложные циклы, теории и ошибки на пути к современному представлению о данном процессе не стоит забывать.

История изучения образования кислот грибами

Французскому исследователю Мольеру принадлежит пальма первенства идентификации глюконовой кислоты у грибов, им же была показана сильная зависимость количества накапливаемых грибом глюконовой и лимонной кислот от объёма потребления питательных веществ.

Нельзя оставлять без упоминания, пожалуй, крупнейшего учёного, внёсшего вклад в исследование обмена органических кислот у грибов, советского биохимика - профессора Владимира Степановича Буткевича, широко известного в своё время по всему миру, как выдающийся специалист по физиологии высших растений и микроорганизмов. Не менее трети его работ посвящены условиям образования грибами органических кислот (преимущественно лимонной, щавелевой и фумаровой). Буткевич начинал с изучения превращения углеводов в культурах плесневых грибов, результатом которых становились - образование лимонной, щавелевой, фумаровой, глюконовой, янтарной, яблочной, винной и других кислот. В дальнейшем в результате исследований определялась их физиологическая роль. Исследования Буткевича показали, что органические кислоты могут служить не только материалом для дальнейшего окисления, но и основой для синтеза аминокислот. Экспериментальные данные, полученные Буткевичем, легли в основу заводского производства лимонной кислоты с помощью Aspergillus niger.

Из наиболее ранних схем синтеза кислот из углеводов имеется гипотеза образования лимонной кислоты, предложенная ещё Френценом и Шмиттом в 1925 году, она заключается в окислении глюкозы до глюконовой, а затем до сахарной кислоты, которая, теряя воду, переходит в дикетоадипиновую кислоту, далее, путем перестройки (более известной как трансформация бензиловой кислоты) получается лимонная кислота. Гипотеза была поддержана Челленжером, Уокером и Субраманиям и в дельнейшем преобразована в схему: сахар - глюконовая кислота - сахарная кислота - ацетондикарбоновая кислота - малоновая кислота + уксусная кислота - гликолевая кислота - глиоксалевая кислота - щавелевая кислота - углекислота. Однако, согласно полученным Буткевичем ранее данным, лимонная кислота образуется Aspergillus niger из глюкозы путём предварительного окисления её в глюкуроновую кислоту, которая затем подвергается внутренней конденсации с образованием 5-углеродного кольцевого соединения, которое превращается в лимонную кислоту.

В 1929 - 1930 годах, Буткевичем и Фёдоровым была предложена схема, в которой образование фумаровой и янтарной кислот из сахаров идёт в анаэробных условиях в процессе спиртового брожения. Они установили продуцирование янтарной и фумаровой кислот различными видами мукоровых грибов при ацетатной диете.

К концу четвёртого десятилетия большее распространение получила гипотеза появления янтарной кислоты, обнаруживаемой при спиртовом брожении, из глутаминовой кислоты. Теоретическую возможность этого установил ещё в 1909 году немецкий учёный Эрлих.

Рэйстрик и Кларк обнаружили, способность развивития (в присутствии необходимых питательных солей) Aspergillus niger на янтарной, фумаровой, малеиновой, яблочной, винной, молочной, пировиноградной, малоновой, уксусной, гликолевой, глиоксалевой и муравьиной кислотах. При этом в заметных количествах образуется щавелевая кислота в процессе культивирования гриба на растворах янтарной, фумаровой, яблочной или уксусной кислот. Результаты их исследований были подтверждены Бернгауэром и Шеуером, они установили, что из гликолевой кислоты образуется лимонная, а из янтарной -лимонная и щавелевая кислоты.

Работы Кюрри (1927), Вамера (1891, 1907), Бернгауэра (1928), Мольера (1924) и некоторых других исследователей показали, что органические кислоты, образуемые грибами, накапливаются в растворе, а затем исчезают. Что послужило основой представления о промежуточном характере кислот в цепи сахар – углекислота+вода при дыхании. «Уравнение дыхания» Кюрри (1927), Хжоншча и Тиукова (1930): глюкоза - лимонная кислота - щавелевая кислота - СО2. Дабы составить полную картину о теориях метаболизма органических кислот у грибов в начале XX-го века стоит вспомнить работы Костычева С.П. Вклад, внесённый им в оптимизацию условий культивирования для получения лимонной кислоты с помощью Aspergillus niger огромен. В 1925 году Костычев и Фрей обнаружили образование яблочной кислоты путем окислительного дезаминирования оксиглутаминовой кислоты. На счёт лимонной кислоты, Костычев придерживался мнения об образовании её большей частью из сахара, но как побочный продукт при образовании аминокислот и пуриновых производных (Костычев, 1956).

В начале XX века ещё до установления последовательностей реакций цикла Кребса большинство исследователей предполагало теснейшую взаимосвязь образования лимонной, янтарной, яблочной и некоторых других кислот с процессом дыхания. Точный механизм биосинтеза этих кислот стал полностью понятен после установления последовательностей реакций цикла Кребса.

Современные теории и представления

Для селекции штаммов - гиперпродуцентов органических кислот используют облучение ультрафиолетом, наряду с химическими мутагенами (например: азид натрия, этидиум бромид, азиридин, N-нитрозо-N-метилмочевина, этил метансульфонат) используют. У полученных путём длительного воздействия ультрафиолета грибы мутантных штаммов, стимулируется биосинтез глюконовой и лимонной кислот, но возможен и обратный эффект в зависимости от дозы ультрафиолета.

По последним сведениям изменение образования и выделения органических кислот грибами проявляется как в качестве ответной реакции на действие как ксенобиотиков, так и стрессовых факторов физической природы.

Органические кислоты могут играть непосредственную роль в процессах адаптации к фактором стресса, например, участвовать в детоксикации тяжёлых металлов, а также могут выделяться в ответ на другие воздействия, вероятно не имея существенной смысловой нагрузки. Изменение продукции органических кислот зависит от комплексного воздействия факторов среды. Стрессовое воздействие может приводить к непосредственным изменениям продукции органических кислот грибами, а также способствовать образованию форм, отличающихся по кислотопродукции от исходных.

Многими микромицетами органические кислоты выделяются в процессе роста. Максимальную активность в продуцировании органических кислот проявляют микромицеты рода Penicillium и A. niger. Среди органических кислот, выделяемых грибами, преобладают лимонная, янтарная, яблочная, фумаровая, щавелевая и глюконовая кислоты. Больше всего образуется щавелевой и глюконовой кислоты.

Образование в больших количествах глюконовой кислоты можно ожидать только на глюкозных средах. Имея преимущественно экстраклеточную природу синтеза глюконовая кислота значительно отличается. До 100% глюкозы, содержащейся в среде, перерабатывается в глюконовую кислоту. Грибы A. niger и P. citrinum в глюконовую кислоту преобразуют до 25% глюкозы, имеющейся в среде. При этом проходит стимуляция роста. Полагается, что в сообществе, образуемая одними видами микромицетов глюконовая кислота может потребляться и использоваться в качестве источника углерода грибами других видов.

Есть предположения, что образование комплексов сахар-кислота у грибов в определённой степени способствует более лёгкой ассимиляции углеводов. Но под собой данная теория не имеет экспериментальной основы.

Химический состав низкомолекулярных компонентов листового опада и биоплёнок на поверхности камня создают на поверхности камня, условия, благоприятные для роста и образования щавелевой и глюконовой кислот грибами. Среди сахаров в составе биоплёнок и наслоений преобладает глюкоза, которая является подходящим субстратом для продукции щавелевой и глюконовой кислот.

Лимонная, яблочная, янтарная и фумаровая кислоты выделяются только при высокой концентрации сахаров и преимущественно на нитратной среде. Важное значение при этом имеет не только форма азота, но и высокое соотношение C/N. Жидкая питательная среда значительно благоприятнее для образования органических кислот, чем агаризованная. Таким образом, причиной выделения грибами лимонной, яблочной, янтарной и фумаровой кислот является, по-видимому, избыточная концентрация сахаров в исходной среде, и их продуцирование микромицетами маловероятно в литобионтных сообществах.

Оксалат доминирует среди выделяемых грибами органических кислот в естественных биогеоценозах. Щавелевая кислота выполняет различные функции. Её геохимическое значение: связывание катионов металлов, вторичное минералообразование, растворение некоторых минералов и перевод ряда элементов в доступные для грибов и растений формы. Щавелевая кислота может подавлять рост других микроорганизмов в сообществах и играть, таким образом, роль в аллелопатиии. Выделение щавелевой кислоты (самой сильной органической кислоты) вызывает быстрое подкисление наружной среды, что приводит к активации работы кислых гидролаз в клеточных стенках растений, способствуя их разрушению и проникновению гиф грибов в ткани растении, а также способствует установлению трофической связи между корнями растений и гифами грибов.

В основном синтез щавелевой кислоты идёт гидролизом щавелевоуксусной кислоты цитоплазматической оксалоацетат ацетилгидролазой. Формирование предшественника щавелевой кислоты, оксалоацетата, возможно в цитоплазме из пировиноградной кислоты под действием фермента пируваткарбоксилазы или путём окисления яблочной кислоты малатдегидрогеназой. Окисление малата в оксалоацетат сопровождается образованием НАДН. Синтез оксалата является, таким образом, энергетически выгодным процессом, а выделяемая в среду щавелевая кислота – побочный продукт окисления сахаров.

Заключение и выводы

Выделение щавелевой кислоты в меньшей степени зависит от концентрации сахаров, чем выделение кислот цикла Кребса, но заметно снижается в условиях роста (который происходил более активно) на нитрат-аммонийном источнике азота по сравнению с нитратным. На стандартной питательной среде наличие аммония совместно с нитратом стимулирует рост мицелия, а на средах с добавлением тяжёлых металлов наблюдается противоположная зависимость. В присутствии цинка на нитратных средах происходит стимуляция продукции оксалата, и рост подавляется меньше, по сравнению с нитрат-аммонийной средой, а на мицелии формируются кристаллы оксалата цинка. На нитрат-аммонийных средах цинк не стимулирует продукцию щавелевой кислоты, так как условия для её образования не подходящие, и рост мицелия при этом замедляется в большей степени, чем на нитратной среде. Низкое содержание связывающих металлы органических кислот на нитрат-аммонийной среде приводит к активному поступлению Zn2+ и Cu2+ в клетки и накоплению их в вакуолях, что в свою очередь способствует формированию увеличенных в размерах клеток.

У P. citrinum образование щавелевой кислоты стимулируется медью только при низкой её концентрации в среде, в процессе длительной адаптации к Cu происходит увеличение активности продукции этой кислоты.

Щавелевая кислота способствует устойчивости грибов к тяжёлым металлам, но, поскольку её продукция в значительной степени определяется составом питательной среды, в частности источником азота, то условия роста могут являться определяющим фактором успешной адаптации грабов к тяжёлым металлам. Показателен пример Aureobasidium pullulans - у грибов, не выделяющих органических кислот, реализуется другая стратегия защиты от тяжёлых металлов, связанная, в частности, с изменением морфологии.

Карбонат кальция, добавленный в среду, также стимулирует продукцию оксалата микромицетами. При этом среди штаммов A. niger, выделенных с различных субстратов, наиболее активно выделяют щавелевую кислоту изоляты с субстрата, содержащего кальций в высокой концентрации и легко доступной для грибов форме. При хранении культур в условиях in vitro их ацидопродуцирующая активность снижалается. Таким образом, можно полагать, что хотя стандартные среды Чапека и Роллена не содержат солей кальция, в норме присутствующего в природных субстратах, продукция оксалата является закрепленным адаптивным свойством грибов в условиях их произрастания на природных субстратах с высокими концентрациями кальция.

Литература

1. Баринова (Сазанова) К. В. Исследование кислотосинтетических особенностей микромицетов , изолированных с каменного субстрата / К . В. Баринова, Ю. В. Рябушева// Материалы III Международного симпозиума «Биокосные взаимодействия : жизнь и камень». ˗ СПб , 2007. ˗ С . 164-166.

2. Исследования над анаэробным дыханием растений // Ботан. записки при Бот. саде СПб. ун-та. 1907. Вып. 25. С. 1—162.

3. Баринова (Сазанова) К. В. Образование органических кислот микромицетами в условиях культуры / К . В . Баринова , С . М. Щипарёв , Д. Ю. Власов // Экологическая школа в Петергофе – Наукограде Российской Федерации»: 2009 «Биоразнообразие и биоиндикация в естественных и трансформированных Экосистемах северо – западного региона » – Старый Петергоф , СПб, 2009. ˗ С. 13-19.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: