Сделай Сам Свою Работу на 5

Выявление генетических маркеров в реакции гибридизации нуклеиновых кислот





 

 

Рисунок 1. Схемы проведения реакции гибридизации нуклеиновых кислот

В фильтрационном тесте образцы ДНК денатурируют и наносят на мембрану. Проводят инкубацию фиксированных образцов с ДНК-зондами, меченными радиоактивным изотопом P32. Промывают мембрану для удаления не связавшихся зондов. Положительные образцы выявляют путем авторадиографии. Возможно использование флюоресцентных ДНК зондов, в этом случае учет результатов реакции проводится в люминесцентном микроскопе. При гибридизации in situ манипуляции с ДНК проводят в интактных образцах ткани, фиксируемых на предметном стекле. После инкубации с ДНК-зондом на стекло наносят фотографическую эмульсию. В зонах радиоактивной эмиссии (т.е. там, где произошла гибридизация) на ней проявляются темные микроскопические гранулы.

 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР – исскуственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro.

 

Исходные компоненты ПЦР

Рисунок 2. Исходные компоненты ПЦР (схема)

 

ДНК-матрица - ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент.



Праймеры - синтетические олигонкулеотиды (последовательности из 20-35 нуклеотидов), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации и определяет качество проводимого анализа.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ)- смесь четырех видов нуклеотидов А, Г, Ц, Т, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.

Фермент Taq-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК.

Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента).

Весь технологический процесс исследования с использованием полимеразной цепной реакции включает:

1) подготовку образца – выделение ДНК и ее очистка;

2)проведение самой полимеразной реакции, направленной на умножение (амплификацию) фрагментов ДНК возбудителя заболевания;



3) оценку результата.

Для проведения полимеразной реакции используется специальное устройство - термоциклер, позволяющее автоматически, по определенной программе изменять температурный режим реакционной смеси.

Каждый цикл ПЦР включает три этапа (см. схему):

1 этап. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при t 93-95оС в течение 30-40 сек.

2 этап. Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65оС. Время отжига -20-60 сек.

3 этап. Элонгация (достраивание цепей ДНК). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72оС. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

 

 

Рисунок 3. Схема полимеразной цепной реакции

 

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации. Накопление ампликонов в растворе происходит по формуле 2n, где n-число циклов амлификации. Для получения достаточного количества копий искомого фрагмента ДНК амплификация включает 20-40 циклов.

Оценка результата

Результаты ПЦР анализируют с помощью метода электрофореза в агаровом геле или иммуноферментного анализа.


ЗАНЯТИЕ № 7

ТЕМА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИОТЕРАПИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ. АНТИСЕПТИКА.

 








Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.