Сделай Сам Свою Работу на 5

Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии





РАЗДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

Изучение строения и свойств белков невозможно без их выделения из клетки и очистки от других белков и органических молекул. Стадии:

1. Разрушение клетокизучаемой ткани и получе­ние гомогената.

2. Разделение гомогената на фракциицентрифуги­рованием, получение ядерной, митохондриальной, цитозольной или иной фракции, содержащей ис­комый белок.

  После перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы:

Избирательная тепловая денатурация- кратко­временное нагревание раствора белков, при котором можно удалить часть денатурированных белковых примесей

. Высаливание.Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли в раство­ре. Постепенно повышая ее концентрацию, мож­но получить ряд отдельных фракций с преимуще­ственным содержанием выделяемого белка в одной из них. Наиболее часто для фракционирования белков используют сульфат аммония. Бел­ки с наименьшей растворимостью выпадают в осадок при небольшой концентрации солей.



5 Гель-фильтрация— метод молекулярного про­сеивания молекул через набухшие гранулы сефа-декса (трехмерные полисахаридные цепи декстра-на, имеющие поры). Скорость прохождения белков через колонку, заполненную сефадексом, будет за­висеть от их молекулярной массы:чем меньше масса молекул, тем легче они проникают внутрь гранул и дольше там задерживаются, чем больше масса, тем быстрее они элюируются с колонки.

Ультрацентрифугирование— метод, заключаю­щийся в том, что белки в центрифужной пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги. При враще­нии ротора скорость оседания белков пропорцио­нальна их молекулярной массе: более тяжелые бел­ки образуют фракции, расположенные ближе ко дну кюветы, более легкие — к поверхности.

Ионообменная хроматография- метод фрак­ционирования, основанный на связывании ионизированных групп белков с противоположно заряженными группами ионообменных нерас­творимых полимеров. Прочность связывания белка со смолой пропорциональна заряду белка.Белки, адсорбированные на ионообменном по­лимере, можно смыть возрастающими концент­рациями NaCl; чем меньше заряд белка, тем меньшая концентрация NaCl потребуется, чтобы смыть белок, прикрепленный к ионогенным группам смолы. Аффинная хроматография— наиболее специфи­ческий метод выделения индивидуальных белков. К инертному полимеру ковалентно присоединяется лиганд какого-либо белка. При пропускании рас­твора белков через колонку с полимером за счет комплементарного связывания белка с лигандом на колонке адсорбируется только специфичный для данного лиганда белок.



Электрофорез белков

Метод основан на том, что при определён­ном значении рН и ионной силы раствора бел-

ки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки — к катоду (—).

Электрофорез проводят на различных носи­телях: бумаге, крахмальном геле, полиакрила-мидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду,в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в по­лиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови че­ловека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, а,-глобулины, а2-глобули­ны, в-глобулины и у-глобулины Элек­трофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёр­ным). Окрашенный комплекс белков с красите­лем выявляет расположение различных фракций на носителе.



 

3) Хроматография.Принцип основан на способности веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.

Ионообменная хроматография

метод основан на разделении белков, различающихся суммар­ным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании ра­створа белков через хроматографическую колон­ку, заполненную твёрдым пористым заряжен­ным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаи­модействий .

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники — полимерные органические вещества, содержащие заряженные функцио­нальные группы.

Различают положительно заряженные анио-нообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу , и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионооб-менник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионо-обменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть буферными раство­рами с различной концентрацией соли, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными фун­кциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли -СМЫВАются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепен­ное увеличение концентрации соли или измене­ние рН, что меняет заряд белковой молекулы, при­водит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на изби­рательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, запол­ненную иммобилизованным лигандом, пропус­кают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные бел­ки выходят с элюатом (рис. 1-58). Белок, ад­сорбированный на колонке, можно снять, про­мыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разры­вающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии

Смесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с ка-тионообменной смолой. Такая синтетическая смола содержит прочно связанные с ней отри­цательно заряженные группы (например, остат­ки сульфоновой кислоты ~S03~), к которым присоединены ионы Na+ (

В катионообменник вносят смесь аминокис­лот в кислой среде (рН 3,0), где аминокислоты в основном представляют катионы, т.е. несут по­ложительный заряд. Положительно заряженные аминокислоты присоединяются к отрицательно заряженным частицам смолы. Чем больше сум­марный заряд аминокислоты, тем прочнее её связь со смолой. Так, аминокислоты лизин, ар­гинин и гистидин наиболее прочно связывают­ся с катионообменником, а аспарагиновая и глу-таминовая кислоты — наиболее слабо.

Высвобождение аминокислот из колонки осу­ществляют вымыванием (элюированием) их буферным раствором с увеличивающейся ион­ной силой (т.е. с увеличением концентрации NaCl) и рН. При увеличении рН аминокисло­ты теряют протон, в результате уменьшается их положительный заряд, а следовательно и проч­ность связи с отрицательно заряженными час­тицами смолы.

Каждая аминокислота выходит из колонки при определённом значении рН и ионной силы. Со-бирая с нижнего конца колонки раствор (элюат) в виде небольших порций, можно получить фрак­ции, содержащие отдельные аминокислоты.

 

4):Азотометрические методы основаны на определении количества белкового азота, образующегося при разрушении аминокислот, входящих в состав белков.. В методе Кьельдаля, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до иона аммония и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, ион аммония может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения иона аммония в молекулярный азот под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы. Исходя из того, что белки из биологических объектов содержат в среднем 16 % азота, полученное в результате анализа количество азота умножают на коэффициент 6,25. Недостатком азотометрических методов является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в ряде случаев в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости.

Гравиметрические методыГравиметрические (весовые) методы определения белка основаны на высушивании белков до постоянной массы и взвешивании на аналитических весах. Методы трудоемки и в настоящее время практически не используются для определения общего белка сыворотки. Гравиметрический метод продолжает использоваться в некоторых лабораториях для определения фибриногена в плазме крови.

«Преципитационные» методы определения общего белка основаны на снижении растворимости белков и образовании суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Результаты данной группы методов зависят от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих индивидуальных белков с использованием специфических антител.

Спектрофотометрические методы определения общего белка сыворотки крови основаны на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области.

Растворы белка обладают поглощением при 270–290 и 200–225 нм. Поглощение при 270–290 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот — тирозина, триптофана и фенилаланина. Поглощение при 200–225 нм практически в 20 раз выше, чем при 280 нм, и обусловлено главным образом пептидными связями.

Точность и специфичность методов определения белка, основанных на поглощении при 270 –290 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках сыворотки крови. Кроме того, присутствие в сыворотке свободных аминокислот — тирозина и триптофана, мочевой кислоты и билирубина, поглощающих при 280 нм, вносит определенную погрешность. В связи с этим данный метод не используют для прямого определения содержания общего белка в сыворотке.

Напротив, поглощение в ультрафиолетовой области — 200 – 225 нм обусловлено в основном пептидными связями, в связи с чем величина поглощения различных белков сыворотки различается незначительно. В этом спектральном диапазоне закон Бера соблюдается при концентрации белка в сыворотке до 120 г/л.

Определение общего белка сыворотки крови с помощью прямой фотометрии при 210 нм обеспечивает получение результатов, сравнимых с биуретовым методом и методом Кьельдаля. В то же время данный метод практически не применяется из-за необходимости использования кювет, не поглощающих при 210 нм, и монохроматора, что удорожает метод.

Рефрактометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на способности растворов белка к преломлению светового потока. показатель преломления воды равен 1,3332,. Калибровку прибора проводят сывороткой с известной концентрацией белка. Простота делает рефрактометрию удобным методом для определения содержания общего белка в сыворотке крови, хотя при ряде заболеваний, в частности, при сахарном диабете, хронической почечной недостаточности его использование может приводить к существенной ошибке.

Колориметрические методы определения общего белкаоснованы на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя.

Среди колориметрических методов определения концентрации общего белка сыворотки наиболее распространенным считается биуретовый метод, основанный на так называемой «цветной биуретовой реакции», в ходе которой белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет, интенсивность окраски зависит от концентрации общего белка в сыворотке. Биуретовый метод определения общего белка в сыворотке крови был утвержден в качестве унифицированного

Колориметрические методы определения общего белка сыворотки крови достаточно просты и относительно дешевы. К недостатку метода относится интерферирующее действие некоторых веществ (в том числе лекарств).

 

 

5) По формемолекул белки можно разделить на две большие группы — глобулярные (имеющие сфериче­скую форму) и фибриллярные (удлиненной формы).

К глобулярным относят бел­ки, у котор.молекула имеет форму эллипса.их Большинство и. Они имеют компактную структуру и многие из них, за счёт удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы, хорошо растворимы в воде. Нагляд­ные примеры строения и функционирования глобулярных белков — рассмотренные выше миоглобин игемоглобины.

Фибриллярные белки имеют вытянутую, ни­тевидную структуру, К фибриллярным белкам относят кол­лагены, эластин, кератин, выполняющие в орга­низме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин — белок свёртывающей системы кро­ви.

 








Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.