Сделай Сам Свою Работу на 5

ОСОБЕННОСТИ ПОГЛОЩЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ





Для боковых групп таких аминокислот, как Asp, Glu, Asn, Gln, Arg и His, наблюдаются электронные переходы, полосы которых маскируются рассмотренным выше интенсивным поглощением пептидной группы. Поэтому зарегистрировать эти переходы в белках или полипептидах практически нельзя. С одной стороны они уступают по интенсивности n → π*-переходу пептидной группы, с другой - число соответствующих боковых радикалов обычно меньше, чем число пептидных групп. Таким образом, интерес могут представлять только те хромофору белковых молекул, которые проявляются при длинах волн больше 230 нм, где вклад в поглощение пептидных групп пренебрежимо мал. Такими свойствами обладают Phe, Туг и Тгр, а также гистидиновый фрагмент и дисульфидный мостик цистина. Спектры поглощения этих трех ароматических аминокислот при нейтральных рН представлены на рис. 2.3.2.

Использование логарифмической шкалы обусловлено большими различиями в экстинкции. Поглощение триптофана значительно сильнее, чем двух других аминокислот. Однако он редко присутствует в белках в больших количествах, поэтому вклад тирозина в поглощение белка также оказывается весьма значимым.



 

Рис.2.3.2 Спектры поглощения ароматических аминокислот.
По оси ординат отложены значения молярного коэффициента экстинкции в логарифмической шкале

Поглощение фенилаланина гораздо меньше (ε около 200 М-1·см-1) при 250 нм. По этой причине обнаружить его присутствие в белках, содержащих другие ароматические аминокислоты, оптическими методами почти невозможно. Поглощение фенилаланина при 250 нм обусловлено запрещенным по симметрии π → π*-переходом. Ту же природу имеет полоса при 256 нм в бензоле (εmax = 400). В тирозине локальная симметрия оказывается значительно ниже, а наблюдаемый при 274 нм переход - интенсивнее (εmax = 1400). Аналогичный переход наблюдается в молекуле фенола при 271 нм (εmax = 2000). Спектр индольной боковой группы триптофана имеет сложную природу. В достаточно узком интервале длин волн (от 240 до 290 нм) располагаются три или более электронных перехода.

Изменение рН мало влияет на спектры поглощения изолированных пептидных хромофоров. В противоположность этому тирозин и триптофан весьма чувствительны к рН, так как места протонирования этих молекул непосредственно связаны с системой электронного сопряжения хромофоров. Наиболее ярко это проявляется в спектральном сдвиге у тирозина, когда отщепляется протон ОН-группы (рКа = 10,9) Этот сдвиг можно надежно зарегистрировать, просто измеряя поглощение при 295 нм. Записывая разностные спектры при этой длине волны, можно с высокой точностью следить за ходом титрованием остатков тирозина в белках. В качестве примера на рис. 2.3.3 приведены результаты спектрофотометрического титрования панкреатической РНКазы быка. Участки, изображенные сплошной линией, отвечают данным, не зависящим от времени. Молекула РНКазы содержит шесть тирозиновых остатков. Представленные результаты показывают, что три из них титруются обратимо, причем их рКа равно 10,2, т.е. обычному значению. Три других не титруются и при более высоких рН, вплоть до денатурации белка, что приводит к гистерезису, наблюдаемому при обратном титровании.



Влияние рН на поглощение триптофана не столь существенно, чтобы использовать его для аналогичных измерений. К тому же значения рКатриптофана лежат вне области значений рН, при которых большинство белков сохраняет свою нативность.

Измерение поглощения цистеинов в белках затруднено тем, что наиболее длинноволновый интенсивный переход (λmax = 230 нм) приходится на область поглощения пептидной группы. Полосы поглощения дисульфидных мостиков (цистинов) лежат в более длинноволновой области, с λmax около 250 и 270 нм, но их интенсивность слишком мала (ε = 300), чтобы заметно сказываться на поглощении белка. Тем не менее, вклад этих переходов в оптическую активность белков весьма ощутим.

Поскольку некоторые из упомянутых боковых групп поглощают в той же области, что и пептидные группы, их присутствие иногда затрудняет спектральные исследования белков. Когда белок содержит лишь несколько сильно поглощающих остатков, становятся возможными однозначная идентификация и анализ различных компонентов спектра. Наличие большого количества ароматических остатков затрудняет подразделение спектра вблизи 200 нм на отдельные составляющие, которые отвечали бы боковым группам и пептидному остову.

   

Рис.2.3.3 Спектрофотометрическое титрование панкреатической РНКазы быка.

А. Изменение спектра поглощения с изменением рН и со временем (при рН 12,2). При меньших значениях рН зависимость от времени отсутствует.
Б. Зависимость коэффициента экстинкции при 295 нм от рН.

 








Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.