Сделай Сам Свою Работу на 5

Дефицит аденин фосфорибозилтрансферазы. Строение гена APRT

РНК-полимераза I эукариот: общие сведения

Обратные
ссылки


В отличие от большинства генов, кодирующих белки, гены, которые кодируют РНК, имеющие самостоятельное функциональное значение, транскрибируются РНК-полимеразой I и РНК-полимеразой III . Обычно эти гены представлены в геноме большим числом копий, часто образующих кластеры тандемных повторов.

РНК-полимеразой I образуются первичные транскрипты генов рРНК , известные как 45S-РНК, они имеют в длину около 13000 нуклеотидов. Прежде чем покинуть ядро в составе собранной рибосомной частицы , молекула 45S-РНК подвергается специфическому расщеплению , в результате чего образуется по одной копии 28S-РНК (около 5000 нуклеотидов), 18S-РНК (около 2000 нуклеотидов) и 5,8S-РНК (около 160 нуклеотидов), которые собственно и являются компонентами рибосом. Общее происхождение всех трех типов рРНК из одного и того же первичного транскрипта служит гарантией того, что они образуются в равных количествах. Остальная часть этого транскрипта (около 6000 нуклеотидов) деградирует в ядре. Не исключено, что эти излишние последовательности молекулы-предшественника рРНК играют определенную роль на ранних этапах сборки рибосом, происходящих непосредственно по завершении синтеза 45S-РНК. Синтез гигантского предшественника рибосомных РНК осуществляется РНК-полимеразой I в специализированной внутриядерной органелле, называемой ядрышком, в котором находятся гены рибосомных РНК (рДНК). рДНК представляет собой специализированные участки (т.нзв. ядрышковые организаторы) нескольких хромосом.

 

Как и большинство других высокомолекулярных полипептидов, большие субъединицы РНК-полимераз содержат хорошо различимые структурные и функциональные домены. Клонирование генов соответствующих субъединиц и определение их первичной структуры позволили выявить эволюционно консервативные участки полипептидных цепей и провести мутационный анализ функциональной значимости их отдельных доменов. Для этой цели в полипептидных цепях с помощью направленного мутагенеза заменяли соответствующие аминокислоты и мутантные субъединицы использовали в сборке ферментов из отдельных субъединиц in vitro с последующим анализом свойств таких реконструированных ферментов. На рис. I.4,а суммированы данные, полученные для двух самых больших субъединиц (RPA194 и RPA116) Pol I мышей , которые являются функциональными аналогами бета'- и бета-субъединиц РНК-полимеразы E.coli .



РНК-полимераза I не реагирует на присутствие альфа-аманитина - высокотоксичного вещества, получаемого из бледной поганки в отличие от РНК-полимеразы II , которая очень чувствительна к нему. Клетки высших эукариот содержат около 40000 молекул РНК- полимеразы I. См. также разделы: Регуляция транскрипции РНК-полимеразой I и Промотор РНК-полимеразы I .

РНК-полимераза I эукариот является большим ферментом, построенным по меньшей мере из 11 субъединиц.( Sentenac, 1985 , Lalo и сотр., 1993 , Woychik и сотр., 1990 ). Минимальный фермент Pol I содержит два больших полипептида с молекулярной массой 194 и 116 кДа, которые ассоциированы с несколькими малыми субъединицами (от 3 до 14 в зависимости от метода очистки), молекулярные массы которых лежат в пределах 15- 60 кДа. Третья по величине субъединица Pol I мышей с молекулярной массой 53 кДа, названная PAF53 (polymerase associated factor 53) , играет важную роль в узнавании Pol I своих промоторов и, по- видимому, является структурным и функциональным аналогом белка RPA49 дрожжей . Pol I дрожжей в отсутствие субъединиц RPA49 и RPA35.5 (так называемая Pol I*) эффективно транскрибирует при низких концентрациях солей искусственную матрицу poly[d(A-T)], но не нативную двухцепочечную ДНК. Полагают, что эти субъединицы необходимы для эффективного образования инициационных комплексов.

Используя антитела к отдельным субъединицам Pol I и последующую иммунопреципитацию, установили, что в клетке часть Pol I находится в составе больших комплексов, с которыми ассоциированы факторы транскрипции. Пять компонентов холофермента Pol I изучены в настоящее время наиболее детально.

Было показано, что РНК-полимераза I (аналогично РНК-полимеразе II ) может существовать в двух формах: одна форма способна инициировать специфическую транскрипцию in vitro, а другая форма, хотя и имеет ДНК-зависимую РНК- полимеразную активность in vitro, не способна к специфической инициации ( Bateman и Paule, 1986 , Tower и Sollner-Webb, 1987 , Buttgereit и сотр., 1985 , Mahajan и Thompson, 1990 ). Есть данные указывающие на то, что активная и неактивная формы РНК- полимеразы I отличаются степенью фосфорилирования и, возможно, определенными посттрансляционными модификациями ( Bateman и Paule, 1986 , Tower и Sollner-Webb, 1987 ).

Для транскрипции рДНК in vitro, помимо самой РНК- полимеразы I, необходимы два фактора транскрипции - UBF и SL1 . Фактор UBF способен связываться с промотором непосредственно, в то время как для связывания SL1 необходимо присутствие UBF ( Smith и сотр., 1990 , Bell и сотр., 1988 , Iida и Paule, 1992 , McStay и сотр., 1991 , Schnapp и Grummt, 1991 ). В экспериментах по транскрипции рДНК in vitro было обнаружено, что некоторый минимальный уровень транскрипции поддерживается и при отсутствии UBF ( Smith и сотр., 1990 , Iida и Paule, 1992 , Smith и сотр., 1993 ).

Одно из возможных объяснений данного эффекта предполагает роль UBF как стимулятора транскрипции рДНК в периоды роста и развития, в то время как в фазе покоя поддерживается минимальный уровень транскрипции, не требующий участия транскрипционных факторов. С другой стороны, при транскрипции in vitro используются значительно более высокие концентрации рДНК матрицы по сравнению с внутриклеточными концентрациями, что может приводить к некоторому минимальному уровню транскрипции в отсутствии UBF.

РНК-полимераза

[править]

Материал из Википедии — свободной энциклопедии

Перейти к: навигация, поиск

РНК-полимераза из клетки T. aquaticus в процессе репликации. Некоторые элементы фермента сделаны прозрачными, и цепи РНК и ДНК видны более отчётливо. Ион магния (жёлтый) располагается на активном участке фермента.

РНК-полимераза — фермент, осуществляющий синтез молекул РНК. В узком смысле, РНК-полимеразой обычно называют ДНК-зависимые РНК-полимеразы, осуществляющие синтез молекул РНК на матрице ДНК, то есть осуществляющие транскрипцию. Ферменты класса РНК-полимераз очень важны для функционирования клетки, поэтому они имеются во всех организмах и во многих вирусах. Химически РНК-полимеразы являются нуклеотидил-трансферазами, полимеризующими рибонуклеотиды на 3'-конце цепи РНК.

[править] История изучения

РНК-полимераза была открыта независимо Сэмом Вайссом и Джерардом Хурвицем в 1960.[1] К этому моменту Нобелевская премия по медицине в 1959 году уже была присуждена Северо Охоа и Артуру Корнбергу за открытие вещества, которое считали РНК-полимеразой[2], впоследствии оказавшегося рибонуклеазой.

Нобелевская премия по химии в 2006 году была присуждена Роджеру Корнбергу за получение точных изображений молекул РНК-полимеразы в различные моменты процесса транскрипции.[3]

[править] Управление транскрипцией

 

Электронная микрофотография нитей ДНК, обвешанных сотнями молекул РНК-полимеразы, слишком маленьких для такого разрешения. Каждая РНК-полимераза транскрибирует нить РНК, которая видна на фотографии как ответвление от ДНК. Отметкой «Begin» указан 5'-конец ДНК, с которого РНК-полимераза начинает транскрипцию; «End» — 3'-конец, у которого транскрипция более длинных молекул РНК завершается.

Управление процессом транскрипции генов позволяет контролировать экспрессию генов и таким образом позволяет клетке адаптироваться к изменяющимся условиям внешней среды, поддерживать метаболические процессы на должном уровне, а также выполнять специфические функции, необходимые для существования организма. Неудивительно, что действие РНК-полимеразы очень сложно и зависит от множества факторов (так, у Escherichia coli идентифицировано более 100 факторов, тем или иным способом влияющих на РНК-полимеразу[4]).

РНК-полимераза начинает транскрипцию с особых участков ДНК, называемых промоторами и производит цепочку РНК, комплементарную соответствующей части нити ДНК.

Процесс наращивания молекулы РНК нуклеотидами называется элонгацией. В эукариотических клетках РНК-полимераза может собирать цепочки из более 2,4 млн элементов (например, такую длину имеет полный ген белка дистрофина).

РНК-полимераза завершает формирование цепочки РНК, когда встречает в ДНК специфическую последовательность, называемую терминатором.

РНК-полимераза производит следующие разновидности РНК:

  • Матричная РНК (мРНК) — шаблон для синтеза белков в рибосомах.
  • Некодирующая РНК или «РНК-ген» — большой класс генов, кодирующих РНК, на которых не может быть построено белка. Самые известные представители этого класса — транспортная РНК (тРНК) и рибосомная РНК (рРНК), сами участвующие в процессе синтеза белка. Однако начиная с поздних 90-х годов XX столетия было обнаружено много других РНК-генов. Это дало возможность предположить, что РНК-гены играют более значительную роль в клетке, чем было принято считать раньше.
    • Транспортная РНК (тРНК), переносящая аминокислоты к растущей на рибосоме белковой цепочке во время процесса трансляции.
    • Рибосомная РНК (рРНК), входящая в состав рибосомы;
    • МикроРНК, регулирующая активность генов;
    • Каталитическая РНК, обладающая свойствами ферментов.

РНК-полимераза осуществляет синтез с нуля. Это возможно вследствие того, что взаимодействие начального нуклеотида гена и РНК-полимеразы позволяет ей закрепиться на цепочке и обрабатывать следующие нуклеотиды. Это отчасти объясняет, почему РНК-полимераза обычно начинает транксрипцию с АТФ, за которым следует ГТФ, УТФ и затем ЦТФ. В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза обладает также геликазным действием.

[править] Действие РНК-полимеразы

[править] Связывание и инициирование транскрипции

В связывании РНК-полимеразы участвует α-субъединица, распознающая элемент ДНК, предшествующий гену (-40…-70 шагов), и σ-фактор, распознающий участок −10…-35. Существует большое количество σ-факторов, контролирующих экспрессию генов. Например: σ70, который синтезируется в нормальных условиях и позволяет РНК-полимеразе связываться с генами, отвечающими за метаболические процессы клетки; или σ32, блокирующий связывание РНК-полимеразы с генами белков теплового шока.

После связывания с ДНК структура РНК-полимеразы превращается из закрытой в открытую. Это превращение включает в себя разделение моноспиралей ДНК с образованием раскрученного участка длиной около 13 шагов. Рибонуклеотиды затем собираются в цепочку в соответствии с базовой нитью ДНК, используемой в качестве шаблона. Суперскрученность молекул ДНК играет существенную роль в деятельности РНК-полимеразы: поскольку участок ДНК перед РНК-полимеразой раскручен, в нем существуют положительные компенсационные супервитки. Участки ДНК позади РНК-полимеразы снова закручиваются и в них присутствуют отрицательные супервитки.

[править] Элонгация

Во время элонгационной фазы транскрипции происходит добавление рибонуклеотидов к цепи и переход от структуры РНК-полимеразного комплекса от открытой к транскрипционной. По мере сборки молекулы РНК участок ДНК перед РНК-полимеразой раскручивается далее, и 13-парный открытый комплекс превращается в 17-парный транскрипционный комплекс. В этот момент промотор (участок ДНК −10…-35 шагов) завершается, и σ-фактор отделяется от РНК-полимеразы. Это позволяет остальному РНК-полимеразному комплексу начать движение вперед, так как σ-фактор удерживал его на месте.

17-парный транскрипционный комплекс содержит гибрид ДНК и РНК, содержащий 8 пар оснований — 8-шаговый участок РНК, соединенный с шаблонной цепью ДНК. По мере выполнения транскрипции рибонуклеотиды добавляются к 3'-концу собираемой РНК, и РНК-полимеразный комплекс движется по цепи ДНК. Хотя в РНК-полимеразе не обнаружено свойств, характерных для 3'-экзонуклеазы, аналогичных проверочной деятельности ДНК-полимеразы, есть свидетельства того, что РНК-полимераза останавливается и корректирует ошибки в случаях ошибочного формирования пар оснований ДНК-РНК.

Добавление рибонуклеотидов к РНК обладает механизмом, очень близким к полимеризации ДНК. Считается, что ДНК- и РНК-полимеразы могут быть эволюционно связаны. Аспарагиновые остатки в РНК-полимеразе связываются с ионами Mg2+, которые, в свою очередь, осуществляют выравнивание фосфатных групп рибонуклеотидов: первый Mg2+ удерживает α-фосфат нуклеотидтрифосфата, подлежащего добавлению в цепочку. Это позволяет осуществить связывание нуклеотида с 3' OH-группой конца собираемой цепочки и таким образом добавить НТФ в цепочку. Второй Mg2+ удерживает пирофосфат НТФ. Общее уравнение реакции таким образом имеет вид:

(НМФ)n + НТФ --> (НМФ)n+1 + ПФi

[править] Терминация

Терминация транскрипции РНК может быть ρ-независимой либо ρ-зависимой.

ρ-независимая терминация осуществляется без помощи ρ-фактора. Транскрипция палиндромного участка ДНК приводит к формированию шпильки из РНК, зацикленной и связанной с самой собой. Эта шпилька богата гуанином и цитозином, что делает ее более стабильной, нежели гибрид ДНК-РНК. В результате 8-парный гибрид ДНК-РНК в транскрипционном комплексе сокращается до 4-парного. В случае если эти 4 последние пары оснований составлены слабыми аденином и уридином, молекула РНК отделяется.[5]

[править] Бактериальная РНК-полимераза

У бактерий один и тот же фермент катализирует синтез трёх типов РНК: мРНК, рРНК и тРНК.

РНК-полимераза — достаточно большая молекула. Основной фермент содержит 5 субъединиц (~400 кДа):

  • α2: две α-субъединицы связывают остальные элементы фермента и распознают регулирующие факторы. Каждая субъединица состоит из двух доменов: αCКД (С-концевой домен) связывает первый элемент промотора, и αNКД (N-концевой домен) связывается с остальными компонентами полимеразы.
  • β: эта субъединица обладает собственно полимеразным действием, катализируя синтез РНК. Она осуществляет инициацию процесса и управляет элонгацией.
  • β': неспецифически связывается с ДНК.
  • ω: восстанавливает денатурированную РНК-полимеразу обратно в дееспособную форму in vitro. Также обнаружено ее защитное/шаперонное действие на β'-субъединицу у Mycobacterium smegmatis.

Для связывания с промоторными областями ДНК, основной фермент нуждается в еще одной субъединице — сигма (σ). Сигма-фактор значительно снижает сродство РНК-полимеразы к неспецифичным областям ДНК, и в то же время повышает ее чувствительность к определенным промоторам, в зависимости от своей структуры. С его помощью транскрипция начинается с нужного участка ДНК.

Полный голоэнзим таким образом состоит из 6 субъединиц: α2ββ'σω (~480 кДа). В структуре РНК-полимеразы присутствует канавка длиной 55 Å (5,5 нм) и шириной 25 Å (2,5 нм). Именно в эту канавку помещается двойная спираль ДНК, имеющая ширину 20 Å (2 нм). На длине канавки укладывается 16 нуклеотидов.

Молекулы РНК-полимеразы не растворены в цитоплазме. Когда РНК-полимераза не используется, она связывается с неспецифичными областями ДНК в ожидании открытия активного промотора.

[править] Транскрипционные кофакторы

Существуют белки, связывающиеся с РНК-полимеразой и влияющие на ее поведение. Например greA и greB из E. coli усиливают способность РНК-полимеразы расщеплять шаблон РНК у растущего конца цепи. Такое расщепление может «спасти» застрявшую молекулу РНК-полимеразы, а также, вероятно, участвует в устранении ошибок сборки цепи РНК.

Отдельный кофактор Mfd задействован в транскрипционном восстановлении ДНК. Во время этого процесса РНК-полимераза обнаруживает поврежденные участки ДНК и привлекает другие ферменты для ее восстановления.

Многие другие кофакторы обладают регулирующим влиянием, заставляя РНК-полимеразу экспрессировать или не экспрессировать определенные гены.

[править] РНК-полимераза в эукариотических клетках

Главная субъединица РНК-полимераз-I, II и III у человека

Эукариоты обладают различными типами РНК-полимераз, классифицируемыми по типам РНК, которые они производят:

  • РНК-полимераза I, синтезирующая 45S-предшественника рРНК, превращающуюся затем в рРНК 28S, 18S и 5,8S, которые уже образуют главные РНК-секции рибосомы.[6]
  • РНК-полимераза II, производящая предшественников для мРНК, а также для большинства мяРНК и миРНК.[7] Это наиболее хорошо изученный тип РНК-полимеразы. Ввиду того, что транскрипция должна происходить под строгим контролем, РНК-полимеразе II для связывания с промоторами требуется целый набор факторов транскрипции.
  • РНК-полимераза III, синтезирующая тРНК, 5S рРНК и другие малые РНК, присутствующее в ядре и цитозоле.[8]

Существуют также и другие типы РНК-полимеразы, используемые в митохондриях и хлоропластах. Молекулярная масса этих ферментов составляет величину порядка 500 000. Они различаются по чувствительности к альфа-аманитину. РНК-полимераза I нечувствительна к нему, РНК-полимераза III умеренно чувствительна, а РНК-полимераза II сильно ингибируется им.[9]

[править] РНК-полимераза у архей

Археи используют один вид РНК-полимеразы, который тем не менее очень похож на три основных типа РНК-полимераз у эукариот. Некоторые ученые предполагают, что архейная РНК-полимераза в определенном приближении может являться эволюционным предком специализированных эукариотических полимераз.[10]

[править] РНК-полимераза у вирусов

РНК-полимераза вируса Т7, производящая мРНК (показана зелёным) из шаблонной ДНК. Белок показан фиолетовой лентой. Изображение взято с PDB 1MSW.

Многие вирусы содержат РНК-полимеразу. Пожалуй, наиболее хорошо изученная вирусная РНК-полимераза имеется у бактериофага Т7. Эта РНК-полимераза, состоящая из одной субъединицы, похожа на митохондриальную и хлоропластную, а также на ДНК-полимеразу.[11] Считается, что большинство вирусных полимераз произошли от ДНК-полимеразы, а не от сложных многокомпонентных РНК-полимераз.

Вирусные полимеразы очень многочисленны. Многие из них могут использовать в качестве шаблона РНК, а не ДНК, как, например, у вирусов с двуцепочечной РНК или с одноцепочечной РНК негативной полярности. Некоторые вирусы с одноцепочечной РНК позитивной полярности также содержат РНК-зависимые РНК-полимеразы.[12]

[править] Функциональные области

[править] C-концевой домен РНК-полимеразы

[править] Инициирование транскрипции

Домен, расположенный на углекислом конце РНК-полимеразы II осуществляет инициирование транскрипции ДНК. C-концевой домен обычно состоит из порядка 52 повторений последовательности Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser [13]. Фактор транскрипции TFIIH, являющийся киназой, гиперфосфорилирует C-концевой домен РНК-полимеразы, тем самым заставляя полимеразный комплекс начать движение от места инициирования транскрипции.

[править] 5'-кэпирование

Основная статья: 5'-кэп

С-концевой домен также является местом связывания комплекса кэпирования. У эукариот после синтеза 5'-конца мРНК фосфатаза концевой фосфат с 5'-конца полирибонуклеотида фермент гуанозинтрансфераза присоединяет к нему гуанозинмонофосфат. При этом образуется 5',5'-трифосфатная связь. Кэпирующий комплекс затем диссоциирует от мРНК, 5'-кэп из ГТФ связывается с кэп-связывающим комплексом, C-концевого домена РНК-полимеразы. 5'-кэп в структуре мРНК эукариот имеет большое значение для связывания молекул мРНК с рибосомами, а также предотвращает деградацию РНК.

[править] Сплайсосома

Углекисло-концевой домен РНК-полимеразы также является областью связывания со сплайсосомными факторами, участвующими в процессе сплайсинга РНК. Эти факторы способствуют осуществлению сплайсинга и удаление интронов в процессе транскрипции РНК.

[править] Мутация в C-концевом домене

Был проведен ряд исследований поведения РНК-полимеразы при удалении определенных аминокислот из ее C-концевого домена. Показано, что мутации усечения C-концевого домена РНК-полимеразы II влияют на ее способность начинать транскрипцию набора генов in vivo, снижая чувствительность к активационным последовательностям этих генов.

Дефицит аденин фосфорибозилтрансферазы. Строение гена APRT

Первичная структура аденин фосфорибозилтрансферазы человека была установлена в 1986 году ( Wilson J.M.,1986 ).

Ген аденин фосфорибозилтрансферазы человека по протяженности составляет около 2,6 килобаз и состоит из 5 экзонов и 4 интронов. Экзон-интронные сочленения гена представлены в таблице APRT int ( Таблица APRT int ).

Промоторная область гена утрачивает характерные для эукариотических генов "TATA"- и "CCAAT"-boxes и содержит пять "GC"- boxes, выполняющих функцию связывания транскрипционных SpI факторов.

Нуклеотидная последовательность гена аденин фосфорибозилтрансферазы человека была установлена в 1987 году ( Broderick T.P.,1987 ; Hidaka Y.,1987a ). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности гена аденин фосфорибозилтрансферазы представлены на рис. APRT seq ( Рис. APTR seq ).

В настоящее время клонированы гены аденин фосфорибозилтрансферазы мыши ( Sikela J.M.,1983 ; Dush M.K.,1985 ) и хомяка ( Lowy I.,1980 ).См также Ген аденинфосфорибозилтрансферазs (APRT)



©2015- 2019 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.