Сделай Сам Свою Работу на 5

Реакция иммунной флюоресценции (РИФ)

ЗАНЯТИЕ 1.3.5

СИСТЕМА АНТИГЕН-АНТИТЕЛО В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ (ПРОДОЛЖЕНИЕ)

Цель:изучить механизмы взаимодействия АГ-АТ, принципы и методы постановки РСК, РИФ, ИФА.

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

 

  1. РСК. Механизм, компоненты, применение.
  2. РИФ. Механизм, компоненты, применение.
  1. ИФА, иммуноблоттинг. Механизм, компоненты, применение.

 

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

 

· интерпретировать результаты серологических исследований.

 

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ:

методами постановки и оценки результатов серологических реакций

 

Работа № 1. Реакция связывания комплемента (РСК)

Цель: разобрать механизм, освоить различные методы постановки РСК в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.

Самостоятельная работа. Учесть результат РСК, поставленной с целью идентификации возбудителя.

Направление:

Ингредиенты:

I. Опытная система:

1)

2)

3)

4)

Через 30 минут:

I.I Индикаторная система:

1)

2)

Механизм:

 


Постановка:

 

Ингредиенты Опыт КАТ КАГ КС Индикаторная система - ГС
АГ          
АТ          
С          
Физ. раствор          
ЭР (АГ)          
ГС (АТ)          

 

 

 


Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Самостоятельная работа. Оценить результат РСК, с целью выявления комплементсвязывающих АТ в парных сыворотках больного.

Направление:

Ингредиенты:

I. Опытная система:

1)

2)

3)

4)

Через 30 минут:

II. Индикаторная система:

1)

2)

 

Механизм (см. схему выше):

 

Постановка:

I неделя

 

 

 


II неделя

 

 


1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 КС КД КГС

 

Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________



Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 2. Реакция иммунной флюоресценции (РИФ)

 

Цель:разобрать механизм, освоить различные методы постановки РИФ в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.

Самостоятельная работа. Прямой метод постановки РИФ. Разобрать реакцию в соответствии с предложенной схемой.

 

Направление:

Ингредиенты:

1)

 

2)

 

3)

Механизм:

 

 


Постановка:

 

 


Результат:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Самостоятельная работа. Непрямой метод постановки РИФ. Разобрать реакцию в соответствии с предложенной схемой.

Направление:

Ингредиенты:

 

1)

 

2)

 

3)

 

4)

Механизм:

 

 


Постановка:

 

 


Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 3. Иммуноферментный анализ (ИФА)

 

Цель: разобрать механизм, освоить различные методы постановки ИФА в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.

Самостоятельная работа. Прямой метод постановки ИФА. Разобрать реакцию в соответствии с предложенной схемой.

 

Направление:

Ингредиенты:

1)

2)

3)

4)

5)

Механизм:

 


Постановка:

 


 

 


«О» «КН» «КП»

Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Самостоятельная работа. Непрямой метод постановки ИФА. Разобрать реакцию в соответствии с предложенной схемой.

 

Направление:

Ингредиенты:

1)

2)

3)

4)

5)

Механизм:

 


Постановка:

I неделя

 

 


II неделя

 


 

1/14 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 «КН» «КП»

Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Подпись преподавателя ________________________________________________________

Самостоятельная работа во внеурочное время:

Решить задачи:

I. В клинику поступил пациент с предполагаемым диагнозом «Хроническая гонорея». Для подтверждения диагноза проведено серологическое исследование путем постановки РСК. Титр первой недели 1/128, второй – 1/128. Изучите механизм РСК, запишите ингредиенты. Сделайте вывод о предполагаемом диагнозе.

Ингредиенты для постановки РСК:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

4.___________________________________________________________________________

5.___________________________________________________________________________

6.___________________________________________________________________________

Результатом первой фазы РСК является_____________________________________________________________________

Результатом второй фазы РСК является_____________________________________________________________________

Феномен реакции _____________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

II. У пациента с подозрением на сибирскую язву взято на исследование отделяемое карбункула. Проведена прямая РИФ. При люминесцентной микроскопии наблюдается свечение.Изучите механизм прРИФ, запишите ингредиенты. Сделайте вывод о предполагаемом диагнозе.

Ингредиенты для постановки прямой РИФ:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Иммунные сыворотки в РИФ обрабатываются______________________________________________________________

Феномен реакции_____________________________________________________________

Вывод_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

III. В анонимный кабинет обратился гражданин Я. С просьбой проверить его на инфицирование ВИЧ. Проведено серологическое исследование с применением ИФА. Обнаружены антигены вируса gp 120 и gp41.. Изучите механизм ИФА, запишите ингредиенты. Сделайте вывод о предполагаемом диагнозе.

Иммуноферментный анализ основан на:

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ингредиенты для постановки ИФА:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

4.___________________________________________________________________________

Феномен реакции_____________________________________________________________

Вывод:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Подпись преподавателя ________________________________________________________


Теоретическая справка

Реакции иммунного лизиса

 

Антитела могут вызывать лизис, т.е. растворение клеток, только при участии комплемента (С). Следовательно, все реакции с участием С называются реакциями иммунного лизиса. К ним относят: РСК, р. гемолиза, р. бактериолиза.

Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты и другие клетки.

2. Антитела (лизины) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериологическая сыворотка содержит антитела, лизирующие бактерии, гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов, лизис спирохет вызывают спирохетолизины, клеток - цитолизины и т. д. Титр гемолитической сыворотки - ее наибольшее разведение, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента 1:10.

3. Комплемент - неспецифический белок, содержащийся в сыворотке

человека и теплокровных животных. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок.

Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не позже 1-2-го дня после получения. Консервированный комплемент (на 10 мл сыворотки 0,2 г борной кислоты и 0,3 г сульфата натрия) сохраняется при 4°С до 2 недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют изотоническим раствором хлорида натрия до первоначального объема, указанного на этикетке.

4. Изотонический раствор хлорида натрия.

К работе № 1

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция связывания комплемента протекает в 2 фазы. В первой (специфической) взаимодействуют антиген, антитело и комплемент. Если антиген соответствует антителу, они соединяются и образуют комплекс, который связывает комплемент. Образовавшееся соединение внешне не проявляется. Об его образовании узнают с помощью индикатора, которым является гемолитическая система, участвующая во второй (индикаторной) фазе реакции. Гемолитическая система состоит из эритроцитов барана и соответствующей гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, реагируя с эритроцитами, делает их чувствительными (сенсибилизирует) к действию комплемента, в присутствии которого эритроциты разрушаются (лизируются). Если лизиса нет, комплемент связан первой системой и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу. Отсутствие гемолиза регистрируют как положительный ответ. Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Свободный комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз эритроцитов, результат РСК при этом отрицательный.

Для постановки РСК требуется точное определение количественных соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой сыворотки, антигена, комплемента, гемолитической сыворотки кролика и эритроцитов барана. Поэтому, постановке основного опыта предшествует титрование гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разведения, титрование других ингредиентов.

В РСК используют:

1. Прогретую (инактивированную) сыворотку при 56°С в течение 30 мин, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Обычно сыворотку больного применяют в разведении 1:5-1:10, иммунные (диагностические) сыворотки – в разведении 1:50 и более.

2. Диагностикум.

3. Комплемент в рабочей дозе. Перед опытом С обычно титруют, т. е. определяют наименьшее его количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С. Титруют С по схеме.

4. Эритроциты барана. Используют 3% взвесь отмытых эритроцитов барана.

5. Гемолитическая сыворотка.

В РСК применяют гемолитическую сыворотку в тройном титре. Например, если титр гемолитической сыворотки составляет 1/200, то рабочее разведение сыворотки составляет 1/400, следовательно, к 0,1 мл гемолитической сыворотки следует добавить 39,9 мл изотонического раствора хлорида натрия.

 

К работе № 2

Реакция иммунной флюоресценции (РИФ)

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки обрабатывают флюорохромами (ФИТЦ), которые соединяются с антителами. Сыворотки при этом не теряют своей иммунной специфичности. При взаимодействии полученной люминесцентной сыворотки с соответствующим антигеном образуется специфический светящийся комплекс, легко видимый в люминесцентном микроскопе.

Различные иммунофлюоресцентные сыворотки могут быть использованы для прямого и непрямого метода иммунофлюоресценции. При прямом методе специфические флюоресцирующие иммунные сыворотки готовят для каждого микроба путем иммунизации кролика убитой культурой возбудителя, затем иммунную сыворотку кролика соединяют с флюорохромом (изоционат или изо-тиоционат флюоресцеина). Метод применяется для экспресс-диагностики с целью обнаружения бактериальных или вирусных антигенов.

Непрямой метод предусматривает использование диагностической иммунной не флюоресцирующей сыворотки (иммунизированного кролика или больного человека) и флюоресцирующей сыворотки, имеющей антитела против видовых глобулинов диагностической сыворотки.

К работе № 3



©2015- 2019 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.