Методы изучения структуры веществ

Рентгеноструктурный анализ: 1)По дифракционным картинам, получаемым при прохождении через кристалл рентгеновского пучка, определяют межатомные расстояния и устанавливают структуру кристалла; 2)Широко применяется для определения структуры молекул белков и нуклеиновых кислот; 3)Длины и углы связей, точно установленные для малых молекул, используются как стандартные значения в предположении, что они сохраняются такими же и в более сложных полимерных структурах; 4)Одним из этапов определения структуры белков и нуклеиновых кислот является построение молекулярных моделей полимеров, согласующихся с рентгеновскими данными и сохраняющих стандартные значения длин связей и валентных углов

Ядерный магнитный резонанс: 1)В основе – поглощение электромагнитных волн в радиочастотном диапазоне ядрами атомов, обладающими магнитным моментом; 2)Поглощение кванта энергии происходит, когда ядра находятся в сильном магнитном поле ЯМР-спектрометра; 3)Различные по химическому окружению ядра поглощают энергию в несколько отличающемся по напряжению магнитном поле (или, при постоянном напряжении, несколько отличающиеся по частоте радиочастотные колебания); 4)В результате получается спектр ЯМР вещества, в котором магнитно несимметричные ядра характеризуются определенными сигналами – «химическими сдвигами» по отношению к какому-либо стандарту; 5)Спектры ЯМР дают возможность определить число атомов данного элемента в соединении и число и характер других атомов, окружающих данный

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР): 1)Используется резонансное поглощение излучения электронами

Электронная микроскопия: 1)Используют электронный микроскоп, увеличивающий объекты в миллионы раз; 2)Первые электронные микроскопы появились в 1939 г.; 3)Обладая разрешением ~0,4 нм, электронный микроскоп позволяет «увидеть» молекулы белков и нуклеиновых кислот, а также детали строения клеточных органелл; 4)В 1950 г. были сконструированы микротомы и ножи, позволяющие делать ультратонкие (20–200 нм) срезы тканей, предварительно залитых в пластмассу

Методы выделения и очистки белков: После того, как выбран источник выделения белка, следующим шагом является экстракция его из ткани. Если экстракт, содержащий значительную часть исследуемого белка, получен, из него удалены частицы и небелковый материал, можно приступать к очистке белка. Концентрирование. Его можно проводить путем осаждения белка с последующим растворением осадка в меньшем объеме. Обычно при этом используют сульфат аммония или ацетон. Концентрация белка в исходном растворе должна быть не меньше 1 мг/мл. Тепловая денатурация. На начальном этапе очистки для разделения белков иногда используют тепловую обработку. Она эффективна, если белок относительно устойчив в условиях нагревания, в то время как сопутствующие белки денатурируют. При этом варьируют рН раствора, продолжительность обработки и температуру. Для выбора оптимальных условий предварительно проводят серию небольших опытов. После проведения первых этапов очистки белки далеки от гомогенного состояния. В полученной смеси белки отличаются друг от друга растворимостью, молекулярной массой, величиной суммарного заряда молекулы, относительной стабильностью и т.д.Осаждение белков органическими растворителями.Это один из старых методов. Он играет важную роль при очистке белков в промышленных масштабах. Чаще всего используют такие растворители как этанол и ацетон, реже – изопропанол, метанол, диоксан. Основной механизм процесса: по мере возрастания концентрации органического растворителя снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Происходит снижение растворимости белков до уровня, при котором начинается агрегация и осаждение. Важным параметром, влияющим на осаждение, является размер молекулы белка. Чем больше молекула, тем ниже концентрация органического растворителя, вызывающая осаждение белка. Гельфильтрация С помощью метода гельфильтрации можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размерами. Носителем для хроматографии является гель, который состоит из поперечно-сшитой трехмерной молекулярной сетки, сформированной в виде шариков (гранул) для удобства наполнения колонок. Так сефадексы - это поперечно-сшитые декстраны (α-1→6-глюканы микробиального происхождения) с заданными размерами пор. Сшиты цепи декстрана трехуглеродными мостиками с помощью эпихлоргидрина. Чем больше поперечных сшивок, тем меньше размеры отверстий. Полученный таким образом гель играет роль молекулярного сита. При пропускании раствора смеси веществ через колонку, наполненную набухшими гранулами сефадекса, крупные частицы, размер которых превышает размер пор сефадекса, будут двигаться быстро. Мелкие молекулы, например, соли, будут двигаться медленно, поскольку в процессе движения они проникают внутрь гранул. Электрофорез

Фракционирование. Факторы, влияющие на результаты: рН, концентрация электролитов. Необходимопостоянно измерять активность фермента.

· фракционное осаждение при изменении рН

· фракционная денатурация нагреванием

· фракционное осаждение органическими растворителями

· фракционирование солями – высаливание

фракционная адсорбция (А. Я. Данилевский): адсорбент вносят в раствор фермента, затем каждую порцию отделяют центрифугированием

§ если фермент адсорбируется, то его отделяют, затем элюируют с адсорбента

§ если фермент не адсорбируется, то обработку адсорбентом используют для отделения балластных веществ

ферментный раствор пропускают через колонку с адсорбентом и собирают фракции

Ферменты адсорбируются избирательно :колоночная хроматография;электрофорез; кристаллизация – получение высокоочищенных ферментов.

Клетка как минимальная единица жизни.

Современная клеточная теория включает следующие основные положения: Клетка - основная единица строения и развития всех живых организмов, наименьшая единица живого. Кл всех одноклеточных и многоклеточных организмов сходны (гомологичны) по строению, химическому составу, основным проявлениям жизнедеятел. и обмену веществ. Размножение клеток происходит путем их деления, т.е. каждая новая клетка. В сложных многоклеточных организмах клетки специализированы по выполняемой ими функции и образуют ткани; из тканей состоят органы. Кл – это элементарная живая система, способная к самообновлению, саморегуляции и самопроизведению.

Строение клетки. размеры прокариотических клеток составляют в среднем 0,5—5 мкм, размеры эукариотических — в среднем от 10 до 50 мкм.

Различают два типа клеточной организации: прокариотический и эукариотический. Клетки прокариотического типа устроены сравнительно просто. В них нет морфологически обособленного ядра, единственная хромосома образована кольцевидной ДНК и находится в цитоплазме. В цитоплазме имеются многочисленные мелкие рибосомы; микротрубочки отсутствуют, поэтому цитоплазма неподвижна, а реснички и жгутики имеют особую структуру. К прокариотам относят бактерии. Большинство современных живых организмов относится к одному из трех царств –растений, грибов или животных, объединяемых в надцарство эукариот. Организмы делят на одноклеточные и многоклеточные. Одноклеточные организмы состоят из одной единственной клетки, выполняющей все функции. Одноклеточными являются все прокариоты.

Эукариоты — организмы, обладающие, в отличие от прокариот, оформленным клеточным ядром, отграниченным от цитоплазмы ядерной оболочкой. Генетический материал заключён в нескольких линейных двухцепочечных молекулах ДНК (в зависимости от вида организмов их число на ядро может колебаться от двух до нескольких сотен), прикреплённых изнутри к мембране клеточного ядра и образующих у подавляющего большинства комплекс с белками-гистонами, называемый хроматином. В клетках эукариот имеется система внутренних мембран, образующих, помимо ядра, ряд других органоидов (эндоплазматическая сеть, Аппарат Гольджи и др.). Кроме того, у подавляющего большинства имеются постоянные внутриклеточные симбионты прокариоты — митохондрии, а у водорослей и растений — также и пластиды.

Биологические мембраны, их свойства и функции Одной из основных особенностей всех эукариотических клеток является изобилие и сложность строения внутренних мембран. Мембраны отграничивают цитоплазму от окружающей среды, а также формируют оболочки ядер, митохондрий и пластид. Они образуют лабиринт эндр-плазматического ретикулума и уплощенных пузырьков в виде стопки, составляющих комплекс Гольджи. Мембраны образуют лизосомы, крупные и мелкие вакуоли растительных и грибных клеток, пульсирующие вакуоли простейших. Все эти структуры представляют собой компартменты (отсеки), предназначенные для тех или иных специализированных процессов и циклов. Следовательно, без мембран существование клетки невозможно. Плазматическая мембрана, или плазмалемма, — наиболее постоянная, основная, универсальная для всех клеток мембрана. Она представляет собой тончайшую (около 10 нм) пленку, покрывающую всю клетку. Плазмалемма состоит из молекул белков и фосфолипидов. Молекулы фосфолипидов расположены в два ряда — гидрофобными концами внутрь, гидрофильными головками к внутренней и внешней водной среде. В отдельных местах бислой (двойной слой) фосфолипидов насквозь пронизан белковыми молекулами (интегральные белки). Внутри таких белковых молекул имеются каналы — поры, через которые проходят водорастворимые вещества. Другие белковые молекулы пронизывают бислой липидов наполовину с одной или с другой стороны (полуинтегральные белки). На поверхности мембран эукариотических клеток имеются периферические белки. Молекулы липидов и белков удерживаются благодаря гидрофильно-гидрофобным взаимодействиям. Свойства и функции мембран. Все клеточные мембраны представляют собой подвижные текучие структуры, поскольку молекулы липидов и белков не связаны между собой ковалентными связями и способны достаточно быстро перемещаться в плоскости мембраны. Благодаря этому мембраны могут изменять свою конфигурацию, т. е. обладают текучестью. Мембраны — структуры очень динамичные. Они быстро восстанавливаются после повреждения, а также растягиваются и сжимаются при клеточных движениях. Мембраны разных типов клеток существенно различаются как по химическому составу, так и по относительному содержанию в них белков, гликопротеинов, липидов, а следовательно, и по характеру имеющихся в них рецепторов. Каждый тип клеток поэтому характеризуется индивидуальностью, которая определяется в основном гликопротеинами. Разветвленные цепи гликопротеинов, выступающие из клеточной мембраны, участвуют в распознавании факторов внешней среды, а также во взаимном узнавании родственных клеток. Например, яйцеклетка и сперматозоид узнают друг друга по гликопротеинам клеточной поверхности, которые подходят друг к другу как отдельные элементы цельной структуры. Такое взаимное узнавание — необходимый этап, предшествующий оплодотворению. С распознаванием связана и регуляция транспорта молекул и ионов через мембрану, а также иммунологический ответ, в котором гликопротеины играют роль антигенов. Сахара, таким образом, могут функционировать как информационные молекулы (подобно белкам и нуклеиновым кислотам). В мембранах содержатся также специфические рецепторы, переносчики электронов, преобразователи энергии, ферментные белки. Белки участвуют в обеспечении транспорта определенных молекул внутрь клетки или из нее, осуществляют структурную связь цитоскелета с клеточными мембранами или же служат в качестве рецепторов для получения и преобразования химических сигналов из окружающей среды. избирательная проницаемость. Это значит, что молекулы и ионы проходят через нее с различной скоростью, и чем больше размер молекул, тем меньше скорость прохождения их через мембрану. Это свойство определяет плазматическую мембрану как осмотический барьер.Максимальной проникающей способностью обладает вода и растворенные в ней газы; значительно медленнее проходят сквозь мембрану ионы. Диффузия воды через мембрану называется осмосом.Существует несколько механизмов транспорта веществ через мембрану.

Диффузия —проникновение веществ через мембрану по градиенту концентрации {из области, где их концентрация выше, в область, где их концентрация ниже). При облегченной диффузии специальные мембранные белки-переносчики избирательно связываются с тем или иным ионом или молекулой и переносят их через мембрану по градиенту концентрации.

Активный транспорт сопряжен с затратами энергии и служит для переноса веществ против их градиента концентрации. Он осуществляется специальными белками-переносчиками, образующими так называемые ионные насосы. Наиболее изученным является Na^-/ К^--насос в клетках животных, активно выкачивающих ионы Na⁺ наружу, поглощая при этом ионы К^-. Благодаря этому в клетке поддерживается большая концентрация К^- и меньшая Na⁺ по сравнению с окружающей средой. На этот процесс затрачивается энергия АТФ. В результате активного транспорта с помощью мембранного насоса в клетке происходит также регуляция концентрации Mg^2-и Са²⁺.

При эндоцитозе {эндо... — внутрь) определенный участок плазмалеммы захватывает и как бы обволакивает внеклеточный материал, заключая его в мембранную вакуоль, возникшую вследствие впя-чивания мембраны. В дальнейшем такая вакуоль соединяется с лизосомой, ферменты которой расщепляют макромолекулы до мономеров.

Процесс, обратный эндоцитозу, — экзоцитоз (экзо... — наружу). Благодаря ему клетка выводит внутриклеточные продукты или непереваренные остатки, заключенные в вакуоли или пузырьки. Пузырек подходит к цитоплазматической мембране, сливается с ней, а его содержимое выделяется в окружающую среду. Гак выводятся пищеварительные ферменты, гормоны, гемицел-люлоза и др.

Таким образом, биологические мембраны как основные структурные элементы клетки служат не просто физическими границами, а представляют собой динамичные функциональные поверхности. На мембранах органелл осуществляются многочисленные биохимические процессы, такие как активное поглощение веществ, преобразование энергии, синтез АТФ и др.

Функции биологических мембран следующие: Отграничивают содержимое клетки от внешней среды и содержимое органелл от цитоплазмы. Обеспечивают транспорт веществ в клетку и из нее, из цитоплазмы в органеллы и наоборот.Выполняют роль рецепторов (получение и преобразование сит-налов из окружающей среды, узнавание веществ клеток и т. д.). Являются катализаторами (обеспечение примембранных химических процессов). Участвуют в преобразовании энергии.

«Повсюду, где мы встречаем жизнь, мы находим, что она связана с каким-либо белковым телом, и повсюду, где мы встречаем какое-либо белковое тело, которое находится в процессе разложения, мы без исключения встречаем явление жизни»

Белки– высокомолекулярные азотосодержащие органические соединения, характеризующиеся строго определенным элементарным составом и распадающиеся до аминокислот при гидролизе.

Особенности, отличающие их от других органических соединений

1. Неисчерпаемое многообразие структуры и вместе с тем ее высокая видовая уникальность

2. Огромный диапазон физических и химических превращений

3. Способность в ответ на внешнее воздействие обратимо и вполне закономерно изменять конфигурацию молекулы

4. Склонность к образованию надмолекулярных структур, комплексов с другими химическими соединениями

Полипептидная теория строения белка

только Э. Фишер (1902) сформулировал полипептидную теорию строения. Согласно этой теории, белки представляют собой сложные полипептиды, в которых отдельные аминокислоты связаны друг с другом пептидными связями, возникающими при взаимодействии α-карбоксильных СООН- и α-NН₂-групп аминокислот. На примере взаимодействия аланина и глицина образование пептидной связи и дипептида (с выделением молекулы воды) можно представить следующим уравнением:

Наименование пептидов складывается из названия первой N-концевой аминокислоты со свободной NH₂-группой (с окончанием -ил, типичным для ацилов), названий последующих аминокислот (также с окончаниями -ил) и полного названия С-концевой аминокислоты со свободной СООН-группой. Например, пентапептид из 5 аминокислот может быть обозначен полным наименованием: глицил-аланил-серил-цистеинил-аланин, или сокращенно Гли–Ала–Сер–Цис–Ала.

экспериментальные доказательства полипептидной теории строения белка.

1. В природных белках сравнительно мало титруемых свободных СООН- и NH₂-групп, поскольку абсолютное их большинство находится в связанном состоянии, участвуя в образовании пептидных связей; титрованию доступны в основном свободные СООН- и NН₂-группы у N- и С-концевых аминокислот пептида.

2. В процессе кислотного или щелочного гидролиза белка образуются стехиометрические количества титруемых СООН- и NH₂-групп, что свидетельствует о распаде определенного числа пептидных связей.

3. Под действием протеолитических ферментов (протеиназ) белки расщепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами, с концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности действия протеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидролиза доказана последующим химическим их синтезом.

4. Биуретовую реакцию (сине-фиолетовое окрашивание в присутствии раствора сульфата меди в щелочной среде) дают как биурет, содержащий пептидную связь, так и белки, что также является доказательством наличия в белках аналогичных связей.

5. Анализ рентгенограмм кристаллов белков подтверждает полипептидную структуру белков. Таким образом, рентгеноструктурный анализ при разрешении 0,15–0,2 нм позволяет не только вычислить межатомные расстояния и размеры валентных углов между атомами С, Н, О и N, но и «увидеть» картину общего расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи и пространственную ее ориентацию (конформацию).

6. Существенным подтверждением полипептидной теории строения белка является возможность синтеза чисто химическими методами полипептидов и белков с уже известным строением: инсулина – 51 аминокислотный остаток, лизоцима – 129 аминокислотных остатков, рибонуклеазы – 124 аминокислотных остатка . Синтезированные белки обладали аналогичными природным белкам физико-химическими свойствами и биологической активностью.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: