|
Подготовка посевного материала
Для получения инокулята дрожжей Rhodotorula utilis готовят твердую питательную среду (сусло 6 оБ+ 1,5% агара) и пересевают смывом с 1-2 косячков культуры на качалочные колбы объемом 250 мл с 50 мл жидкой питательной среды состава (г/л): барда 10 –30 (или уксуснокислый натрий – 5,0-8,0 ); (NH4)2SO4 – 2,0; (NH4)2HPO4 – 1,8; KCl – 0,5; дрожжевой автолизат – 0,1 (на колбу 1 косячок культуры).
Среду стерилизуют при 0,5 ати и после охлаждения до температуры культивирования засевают суспензией клеток со скошенного агара (1 пробирка на колбу). Для посевного материала культуры выращивают на качалке (150-180 об/мин) в колбах на 250 мл с объемом среды 50 мл при 30-33 оС.
Время выращивания инокулята составляет 18-24 ч. Затем производят засев лабораторного ферментера полученным инокулятом. Количество инокулята составляет ~ 2-5 % от объема питательной среды.
Подготовка мелассной ( послеспиртовой) барды
После отделения мертвых клеток спиртовых дрожжей Saccaromyces cerevisiae и шлама фильтрацией, мелассную барду в зависимости от состава разбавляют, подкисляют до рН 4,0-4,5, добавляют питательные соли и используются для выращивания дрожжевых организмов Rhodotorula utilis.
Таблица 1 – Характеристика мелассной барды
Показатели/компоненты
| Содержание, %
| 1 Сухие вещества
| 8,0 – 9,0
| 2 Органические сухие вещества
| 6,0 –7,0
| 3 Редуцирующие вещества
| 0,2 –0,3
| 4 Карбоновые кислоты
| 1,0 – 1,6
| 5 Глицерин
| 0,5 – 0,7
| 6 Азот общий
| 0,3 – 0,5
|
Проведение периодического культивирования дрожжей в лабораторном ферментере
Процесс культивирования дрожжей Rhodotorula utilis осуществляют в лабораторном ферментере (рабочий объем 3 л), оснащенным барботером (подача воздуха с помощью микрокомпрессора), встроенным змеевиком, позволяющем поддерживать оптимальную температуру культивирования.
Контроль рН осуществляют с помощью рН-метра, подтитровывая питательную среду с помощью раствора серной кислоты до рН 4.5-5,0. Оптимальная температура культивирования 28-30оС, концентрация растворенного кислорода – не менее 2 мг/л.
Содержание сухих веществ определяют ареометром, РВ – методом Шомодьи-Нельсона, карбоновые кислоты – по общей титруемой кислотности.Результаты микробиологического контроля состояния дрожжевой культуры Rhodotorula utilis заносят в таблицу 2. Контроль за состоянием клеток (подсчет растущих, почкующихся, мертвых клеток и др.) производят в камере Горяева (увеличение х40) с использованием светлопольного микроскопа.
Выращивание дрожжей проводят в условиях интенсивной аэрации на жидкой среде следующего состава (г/л), которая представлена в таблице 2.
Таблица 2 – Состав питательной среды для выращивания дрожжей Rhodotorula utilis
Компоненты среды (г/ л)
| Варианты
| I
| II
| Ш
| 1 Мелассная барда (в пересчете на РВ не более 0,1-0,2%)
|
|
|
| 2 Диаммоний фосфат (в пересчете на Р2О5 4,7%)
| 1,2
| 1,2
| 1,2
| 3 Азот в виде солей
- Сульфат аммония
- Карбамид (мочевина)
|
0,9
0,7
|
0,9
0,7
|
0,9
0,7
| 4 Калий хлористый
| 0,5
| 0,5
| 0,5
| 5 Дрожжевой автолизат
| 0,1
| 0,1
| 0,1
|
В качестве пеногасителя используют производные жирных кислот.
Во время ферментации контролируют основные параметры процесса, отбирая пробы каждые 1-2 ч, которые заносят в таблицу 2. Общее время лабораторной ферментации составляет 8-12 ч.
Для анализа накопления биомассы дрожжей, содержания РВ, рН пробы отбирать каждый час, для других видов анализа – 1 раз в 2 ч.
Таблица 3 – Контроль параметров культивирования на лабораторном ферментере
Время отбора проб, ч
| Концентрация биомассы
|
рН
| Контроль параметров (концентрация, мг/л)
| Х, ОД600
мг АСВ в л
| клеток в мл
| Кислород растворен.
|
РВ
| сухие вещества
| Азот
аммонийный
| Фосфа-
ты
| 0-….12
|
|
|
|
|
|
|
|
|
На основании расчета удельной скорости роста в течение 1-2 ч культивирования рассчитать потребность в субстрате (в пересчете на мелассную барду) для осуществления лабораторного культивирования в режиме его дробного внесения и составить график внесения барды с учетом разбавления в культуральной среде (таблица 4)
Таблица 4 – Контроль и режим дозирования субстрата
Время культивирования, ч
| Внесение субстрата (мелассной барды)
| Текущая
концентрация РВ, г/л
| объем питательной среды с бардой, мл
| Концентрация РВ, г/л
| Содержание сухих веществ
| |
|
|
|
|
По окончании культивирования культуральную жидкость отделяют декантацией или сепарацией от биомассы дрожжей. Полученную биомассу дрожжей взвешивают с учетом влажности, и на основании полученных данных делают вывод об эффективности процесса (выход биомассы, коэффициент использования субстрата, продуктивность). В полученной биомассе определяют содержание белка по Къельдалю.
Указания к работе. Соли азота следует вносить в питательную среду лишь в количествах, необходимых для прироста биомассы дрожжей, поскольку азот используется дрожжами наравне с углеродом для синтеза белка. Такая подача азотсодержащих солей способствует оптимизации удельной скорости роста, наибольшему усвоению субстрата и нормализации pH среды.
С учетом этого фактора необходимо до начала культивирования по лабораторному культивированию определить химический состав мелассной (послеспиртовой) барды и оценить содержание остаточного азота, фосфора, карбоновых кислот, РВ и сухие вещества барды.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3
Получение биомассы дрожжей Культивированием
На пшеничных отрубях
Для производства микробных белковых препаратов в качестве источника углерода могут быть использованы крахмалосодержащие вещества, например, отходы сельскохозяйственных, зерноперерабатывающих производств, в том числе отруби, мука и зерно злаковых культур после помола.
В процессе приготовления субстрата его подвергают ферментативному и/или химическому гидролизу преобразуя его в сусло (раствор, содержащий моносахара и олигосахариды), на котором в дальнейшем будет выращиваться микробная культура. Гидролиз проводится или только одним из методов или чаще всего для получения более высокого содержания сахаров (до 1,5-1,8% РВ) включает оба.
Для осуществления ферментативного гидролиза применяют амилолитические ферментные препараты, используемый при температуре 60-70оС и низком рН (3-4) (например, амилосубтилин). Затем осуществляется подготовка и стерилизация питательной среды. Или же получение гидролизатов отрубей осуществляется в процессе приготовления и стерилизации питательной среды. Длительность цикла стерилизации (с охлаждением) составляет до 6 ч.
Дрожжевые грибы Endomicopsis fibuliger в отличие отдрожжевых грибов Saccaromyces cerevisiae характеризуются образованием субстратного мицелия при росте на углеводсодержащих средах и относятся к активным продуцентам амилолитических ферментов. Это свойство может быть использовано для получения микробной дрожжевой биомассы как источника белка или белкового продукта при росте на крахмалосодержащих субстратах, как, например, пшеничные отруби.
В случае совместного (смешанного) культивирования дрожжей-сахаромицетов и микроорганизмов-продуцентов амилаз, которые при росте на углеводсодержащих субстратах сами продуцируют комплекс амилолитических ферментов, возможно получение биомассы микроорганизмов без использования препаратов амилаз.
Цель работы: Изучение процесса накопления микробной биомассы смешанной культуры дрожжевых грибов методом периодического глубинного культивирования на основе пшеничных отрубей.
Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:
©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.
|