Открытие зеленого флуоресцентного белка

Физико-химические механизмы биолюминесценции

В реакциях биолюминесценции, выделяющаяся энергия не рассеивается в виде тепла, как это происходит в ходе большинства экзотермических химических реакций, а расходуется на образование одного из продуктов реакции в возбуждённом электронном состоянии. Для излучения света в ходе хемилюминесцентной реакции необходимо выполнение, как минимум, двух условий: во-первых, энергия, выделяющаяся в ходе реакции должна превышать ~41-71.5 ккал/моль и, во-вторых, разница энергий основного и возбуждённого состояния продукта реакции должна быть ниже энтальпии химической реакции.

При соблюдении этих условий возможно образование с достаточно высоким выходом окисленной формы люциферина в возбуждённом состоянии и дальнейший переход в основное состояние с испусканием фотона видимого спектрального диапазона. Отношение числа излученных фотонов к общему числу элементарных актов реакции называется квантовым выходом реакции, квантовые выходы биолюминесценции, в отличие от большинства хемилюминесцентных реакций, очень высоки и достигают значений 0.1-1. Такие квантовые выходы для реакций, протекающих в водных растворах при нейтральных значениях pH необычны для хемилюминесцентных процессов и обусловлены специфичной ферментативной природой окислительных реакций биолюминесценции, катализируемых люциферазными комплексами.

Длина волны излучаемого при биолюминесцентных процессах света зависит от разности энергий основного и возбуждённого состояний окислённых форм люциферинов и связанна с ней отношением ΔE = hν, полуширина полосы излучения составляет обычно ~50 нм. Поскольку процесс перехода возбуждённое — основное состояние обратим, то спектры флуоресценции оксилюциферинов близки к спектрам биолюминесценции: в обоих случаях излучает молекула оксилюциферина, переведённая в возбуждённое состояние либо вследствие химической реакции (биолюминесценция), либо вследствие поглощения достаточно энергетичного фотона.

Фактором, влияющим на спектр биолюминесценции, является микроокружение молекулы оксилюциферина в основном и возбуждённом состояниях. На значения энергетических уровней основного и возбуждённого состояний молекулы оксилюциферина в среде оказывает влияние и энергия их взаимодействия с растворителем (энергия сольватации), и образование водородных связей: чем сильнее возбуждённая молекула ассоциирована с микроокружением и чем выше его поляризуемость, тем ниже энергия возбуждённого состояния, тем меньше энергия испускаемого фотона и тем сильнее сдвиг максимума спектра излучения в длинноволновую область.

Как уже упоминалось, необходимым условием биолюминесценции является высокая энтальпия реакции окисления люциферина: энергия, выделяющаяся в ходе реакции должна превышать ~41-71.5 ккал/моль, — что соответствует энергиям электромагнитного излучения в видимом диапазоне ~400-700 нм, эта энергия соизмерима с энергией связи C-C в алканах (~79 ккал/моль). Такой энергетический эффект значительно превышает энергетические эффекты большинства биохимических реакций — в том числе и с участием макроэргических соединений — носителей энергии в живых системах; так, например, энергия, высвобождающаяся при гидролизе АТФ до АМФ составляет 10.9 ккал/моль.

Наиболее распространенный реакционный механизм биолюминесценции: отщепление CO2 от диоксетанона — промежуточного продукта окисления люциферина ведёт к образованию оксилюциферина в возбуждённом состоянии, который переходит в основное состояние с излучением света.

Энергия, соответствующая энергиям видимого спектра, в живых системах может быть получена только в реакциях одностадийного окисления с участием молекулярного кислорода (или активных форм кислорода), поэтому большинство люцифераз относятся к классу ферментов — оксигеназ, катализирующих реакции, в которых происходит присоединение кислорода к субстрату-люциферину (за немногими исключениями люцифераз кольчатых червей, обладающих пероксидазоподобной активностью) и, соответственно, все светящиеся организмы являются аэробами.

Открытие зеленого флуоресцентного белка

Восьмого октября на пресс-конференции в здании Шведской академии наук были объявлены лауреаты Нобелевской премии по химии 2008 года. Самой престижной научной награды удостоились американцы Осаму Симомура (Osamu Shimomura) (ученый Мартин Чалфи (Martin Chalfie) и Роджер Тсиен (Roger Tsien) за получение и разработку различных форм зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP).

Значение их открытия настолько сложно переоценить, что Биомолекула решила дать небольшой материал по использованию GFP в современной биотехнологии

Осамо Шимамура (Osamu Shimomura), первооткрыватель зелёного флуоресцентного белка, начал заниматься биолюминисценцией ещё в студенчестве — в 1955 году в Университете Нагойи, где его первой самостоятельной задачей стало определить, почему разлагающиеся моллюски рода Cypridina светятся в темноте. Шимамуре удалось успешно справиться с этой сложной задачей: он выделил ярко флуоресцирующий белок.

Профессура, удивлённая успехами Шимамуры, даже вручила ему степень кандидата наук заочно, несмотря на то, что он даже не был аспирантом. После публикации результатов, его пригласили работать в США, где он продолжил изучать светящиеся организмы, — на этот раз медуз Aequorea victoria. Предание гласит, что в течение всего лета 1961 года Шимамура и его научный руководитель собирали на морском берегу и исследовали медуз, и через их руки и аппарат, в котором они их «перерабатывали», проходило по 3000 организмов в день.

Первым флуоресцирующим белком, выделенным из медузы, стал экворин, светящийся синим светом при окислительном присоединении молекулы целентеразина в присутствии ионов кальция (которые содержатся в морской воде). (Кстати, экворин-целентеразиновая система с тех пор считается одним из основных биохимических сенсоров Ca2+.) Однако самым интересным было то, что экворин давал синее свечение, а сами медузы светились зелёным! Дело, оказывается, было в том, что медуза содержала ещё один флуоресцентный белок, «удостоившийся» почти полвека спустя «Нобелевки», — зелёный флуоресцентный белок (GFP).

Первым упоминанием о GFP можно считать статью Шимамуры, вышедшую в 1962 году. В ней было описано, что под действием света раствор этого белкá приобретает слегка зеленоватый цвет, а ультрафиолет вызывает яркое свечение раствора. И — самое важное — для свечения белка необходим только возбуждающий поток света и кислород в обычных концентрациях, и больше ничего (никаких дополнительных кофакторов — в отличие от экворина). Обо всех этих открытиях можно почитать в замечательном «автобиографическом» обзоре Шимамуры [2].

Этот интересный феномен, правда, в те времена было затруднительно использовать — биотехнология тогда делала ещё только самые первые шаги. Настоящая революция началась после встречи Шимамуры с Мартином Шалфи (Martin Chalfie) на одном из семинаров в Университете Колумбии (Нью-Йорк). Последний работал с прозрачным червём-нематодой Caenorhabditis elegans, и предложил попробовать использовать GFP для «картирования» клеток развивающихся зародышей С. elegans, а также для отслеживания определённых белков внутри клетки. Этому способствовала и бурно развивавшаяся научно-техническая база — на дворе был уже конец 80-х. Результат потрясал — внутри живой клетки можно было проследить за перемещением отдельных видов белков в реальном времени, при чем без особых ухищрений — для этого нужен обычный микроскоп с ультрафиолетовой лампой и светофильтром, пропускающим нужную длину волны.

Оказалось, что с помощью направленного мутагенеза можно не только усилить свечение белка, но и поменять его цвет. Так появились варианты GFP, излучающие в желтой, синей и красной областях спектра. С гордостью надо сказать, что одной из ведущих лабораторий по разработке новых «красок» является лаборатория Сергея Лукьянова в московском Институте биоорганической химии.Лукьянов и его коллеги открыли и описали массу флуоресцирующих и окрашенных белков в морских организмах, которые обычно сами не светятся, но часто флуоресцируют в ультрафиолете, — например в актиниях (Anemonia majano и Ricordia yuma) и кораллах [4]. Что интересно, этих животных учёные брали не из моря, из домашнего аквариума одного из коллег. Кстати «в затылок» русским исследователям дышала группа австралийских учёных, но публикация наших соотечественников, вышедшая в 1999 году [5], прочно закрепила их приоритет в области «цветных» флуоресцентных белков.Однако третьим Нобелевским лауреатом стал не Лукьянов, а Роджер Тсин (Roger Tsien), объяснивший механизм возникновения флуоресценции в белкé, не содержащем кофакторов и не требующем присутствия ионов металла. Кроме того, он всё-таки первым открыл флуоресцентные белкиотличного от зелёного цвета — голубого, синего и жёлтого. В его группе также произвели «переделку» тетрамерного красного белка, открытого Лукьяновым, — с тем, чтобы заставить его работать в качестве мономера и уменьшить молекулярную массу (это необходимо с технологической точки зрения для удобства применения в экспериментах).

Современные светящиеся метки уже далеко превзошли «способности» прадедушки-GFP. Например, на его основе созданы включающиеся-выключающиеся разными длинами света флуоресцентные метки. Для таких белков стало возможным с помощью пучка света включать и выключать свечение молекулы, экономя её «ресурс» (это важно, поскольку флуоресцентные белки «выгорают», и яркость GFP или его аналогов максимальна только в первые минуты, а дальше она постепенно затухает).Создав разноцветные флуоресцентные белки, ученые получили ещё один неожиданный инструмент. Оказалось, что если модифицировать два белкá двумя разноцветными метками, то можно по изменению цвета излучения «видеть» их взаимодействие. Это может происходить, когда длина волны флуоресценции одного белка является возбуждающей для другого (рисунок 4). Так, в норме, возбуждая флуоресценцию голубого белка, мы видим синее излучение. Однако при сближении меченного синим белка-хозяина с его партнером — например субстратом, который мы модифицировали меткой другого цвета, — мы будем видеть затухание синего излучения и возникновение желтого! Модифицировав такой парой два белка, мы теперь можем точно регистрировать их взаимодействиеin vivo, внутри клетки. Этот способ лёг в основу интересного и точного метода, получившего название FRET (Фёрстеровский резонансный перенос энергии).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: