Количественное определение вирулентности.

Для характеристики вирулентности пользуются количественными показателями, определяющими способность исследуемой микробной культуры вызывать гибель искусственно зараженных ею подопытных животных. Изучение вирулентности бывает сопряжено с рядом трудностей, так как она определяется не только комплексом культурно-морфологических, токсигенных и биологических свойств микроба, но и резистентностью микроорганизма, подверженной большим колебаниям в связи с видом, возрастом животных, режимом их питания, температурой внешней среды, а также способом заражения, принятым в опыте. Поэтому при установлении вирулентности микроба очень важно вести исследование, точно соблюдая стандартность всех условий опыта. Для определения вирулентности микробных культур чаще всего используют белых мышей. В том случае, когда белые мыши невосприимчивы к исследуемому возбудителю заболевания, пользуются другими видами животных: крысами, морскими свинками или кроликами. Для определения вирулентности применяют молодую культуру микроба, так как старые культуры содержат большое количество мертвых клеток. Культуру микроба для заражения выращивают на мясо-пептонном агаре или другой плотной питательной среде, так как бульон, представляя собой сложный белковый субстрат, небезразличен для животного организма и может извращать результаты опыта. Исследуемую культуру микроба, выра­щенную на скошенном мясо-пептонном агаре, смывают изотоническим раствором хлорида натрия и стандартизуют по оптическому стандарту так, чтобы в 1 мл этого раствора содержалось определенное количество микробных тел. В зависимости от вида культуры, патогенности ее для животных, взятых в опыт, а также от цели и задач исследования количество микробных тел, содержащееся в 1 мл взвеси, может колебаться от единиц до миллиардов. В тех случаях, когда по каким-либо причинам получить агаровую культуру невозможно, пользуются суточной бульонной культурой. Для определения минимальной летальной дозы из бульонной культуры готовят ряд последовательных десятикратных разведений: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 и т.д. Исследуемую взвесь бактерий вводят различными способами: внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, интраназально—в зависимости от целей и задач исследования. Отстандартизованную взвесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия, а также разведения бульонной культуры готовят с таким расчетом, чтобы различные дозы микроба, используемые в опыте, содержались в одинаковых объемах жидкости. Каждую дозу культуры вводят одновременно нескольким животным. При определении минимальной смертельной дозы учитывают и отмечают в протоколе опыта следующие данные: количество микробов, введенных в организм животного; способ их введения; масса тела зараженного животного; сроки гибели после заражения. Степень вирулентности чаще всего характеризуют тремя следующими показателями: Минимальная смертельная доза Dlm (Dosis letalis minima), т.e. наименьшая доза микробов, которая при определенном способе заражения, в определенных условиях опыта вызывает гибель около 95% подопытных животных. Наименьшая безусловно смертельная доза Dll (Dosis lerie letalis) — наименьшая доза микробов, являющаяся смертельной для всех 100% животных, взятых в опыт. Средняя смертельная доза микробов LD50 (Dosis letalis 50%)—доза микробов, вызывающая гибель 50% зараженных животных. Показатель LD50 позволяет получить более достоверные результаты, и потому он чаще других используется в практике экспериментальных исследований. В отличие от Dlm и Dll, определявшихся непосредственно по результатам опыта, LD50 вычисляется путем довольно сложных математических расчетов. Более прост метод Кербера, в котором простота расчета удачно сочетается с достаточно высокой точностью получаемых результатов.

Аттенуация — искусственное стойкое ослабление вирулентности патогенных микроорганизмов, сохраняющих способность вызывать иммунитет. Аттенуация используется при изготовлении живых вакцин против туберкулеза, оспы. Термин произошел от латинского слова attenuatio — уменьшение.

4. Микробные токсины и их свойства. Генетические детерминанты токсигенности (tox⁺ - гены).

Важную роль в развитии инфекционного процесса играют токсины. По биологическим свойствам бактериальные токсины делятся на экзотоксины и эндотоксины. Экзотоксины продуцируют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. По своей химической структуре это белки. По механизму действия экзотоксина на клетку различают несколько типов: цитотоксины, мембранотоксины, функциональные блокаторы, эксфолианты и эритрогемины. Механизм действия белковых токсинов сводится к повреждению жизненно важных процессов в клетке: повышение проницаемости мембран, блокады синтеза белка и других биохимических процессов в клетке или нарушении взаимодействия и взаимокоординации между клетками. Экзотоксины являются сильными антигенами, которые и продуцируют образование в организме антитоксинов. По молекулярной организации экзотоксины делятся на две группы: экзотоксины состоящие из двух фрагментов; экзотоксины, составляющие единую полипептидную цепь. По степени связи с бактериальной клетки экзотоксины делятся условно на три класса. Класс А - токсины, секретируемые во внешнюю среду; Класс В - токсины частично секретируемые и частично связанные с микробной клеткой; Класс С - токсины, связанные и с микробной клеткой и попадающие в окружающую среду при разрушении клетки. Экзотоксины обладают высокой токсичностью. Под воздействием формалина и температуры экзотоксины утрачивают свою токсичность, но сохраняют иммуногенное свойство. Такие токсины получили название анатоксины и применяются для профилактики заболевания столбняка, гангрены, ботулизма, дифтерии, а также используются в виде антигенов для иммунизации животных с целью получения анатоксических сывороток. Эндотоксины по своей химической структуре являются липополисахаридами, которые содержатся в клеточной стенке грамотрицательных бактерий и выделяются в окружающую среду при лизисе бактерий. Эндотоксины не обладают специфичностью, термостабильны, менее токсичны, обладают слабой иммуногенностью. При поступлении в организм больших доз эндотоксины угнетают фагоцитоз, гранулоцитоз, моноцитоз, увеличивают проницаемость капилляров, оказывают разрушающее действие на клетки. Микробные липополисахариды разрушают лейкоциты крови, вызывают дегрануляцию тучных клеток с выделением вазодилататоров, активируют фактор Хагемана, что приводит к лейкопении, гипертермии, гипотонии, ацидозу, дессиминированной внутрисосудистой коагуляции (ДВК). Эндотоксины стимулируют синтез интерферонов, активируют систему комплемента по классическому пути, обладают аллергическими свойствами. При введении небольших доз эндотоксина повышается резистентность организма, усиливается фагоцитоз, стимулируются В-лимфоциты. Сыворотка животного иммунизированного эндотоксином обладает слабой антитоксической активностью и не нейтрализует эндотоксин. Патогенность бактерий контролируется тремя типами генов: гены - собственной хромосомами, гены привнесенные плазмидами умеренными фагами. Генетические детерминанты токсигенности (tox+ - гены) Синтез белковых токсинов кодируется генами, локализованными в хромосоме и сцепленными с генами, участвующими в спорообразовании или входящими в состав профага, а также генами, локализованными в плазмидах. Это tox+ гены, ответственные за токсиген-ность. Активность tox+ генов контролируется белками-репрессорами микробной клетки. Первоначальной функцией этих генов у сапрофитов был синтез структурных белков фага, компонентов оболочек спор или синтез ферментов, необходимых для усвоения аминокислот. По мере закрепления паразитического образа жизни эти специализированные адаптивные ферменты превратились в яды — белковые токсины. Способность микроорганизмов образовывать белковые токсины необходимо учитывать также при проведении микробиологической диагностики. При этом необходимо помнить, что все патогенные штаммы данного вида могут продуцировать только один тип токсина по антигенной структуре и механизму действия(С. diphtheriae, С. tetani), разные по антигенной структуре, но одинаковые по механизму действия токсины (С. botulinum). С другой стороны, один и тот же вид микроба может образовывать разные типы белковых токсинов, а также эндотоксины, например диареегенные Е. coli, шигеллы и сальмонеллы, возбудитель холеры.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: