Диагностика ГМО - проблемы и решения

ГМО определяют как организм, генетический материал (ДНК) которого модифицирован искусственным, в природе невозможным образом. Вве­дение новых генов в растения позволяет обеспечить синтез новых белков, придающих устойчивость к вредителям (насекомым и вирусам), гербици­дам или позволяющих улучшить качество продукта питания (содержание жирных кислот, витаминов).

Во многих странах применение ГМ технологии, последующий выпуск ГМО в окружа­ющую среду, их применение в сельском хозяйстве, производстве и про­даже продуктов питания строго регламентированы. Наиболее динамично соответствующее законодательство развивается в ЕС и пересматривается Европарламентом практически каждый год. В настоящий момент приме­нение ГМО в ЕС в основном регламентировано директивой 65/2004/ECи постановлениями 1829/2003 и 1830/2003.

В законодательстве ЕС по-разному определены правила применения ГМО в сельском хозяйстве, и в производстве продуктов питания. Если для продуктов питания определена минимальная граница допустимого содержа­ния в продуктах питания генетически модифицированных источников (ГМИ), то для семян/посевного материала она не предусмотрена. Этот норматив позволяет в случаях, когда содержание ГМИ в продукте не достигает порого­вого значения (относительная концентрация 0,9% для ЕС), не маркировать данный продукт как содержащий ГМИ. При этом норматив максимально допустимого содержания ГМИ действует на уровне ингредиента, и порог

0, 9% установлен для каждого ингредиента, входящего в состав пищевого продукта. Таким образом, если в результате скрининговой качественной диагностики ГМИ были обнаружены в продукте питания, соответствующие ингредиенты должны быть исследованы и установлено содержание ГМИ в каждом из них.

В соответствии с санитарными нормами, действующими в России, пороговое значение вначале было установлено в 5%, причем в данном случае подразумевается абсолютная концентрация ГМИ в продукте пита­ния. В настоящий момент этот уровень в Российской Федерации установ­лен в 0,9%, Как показывает опыт, большинство диагностических методов позволяют достоверно оценить относительную концентрацию ГМИ, в то время как определить абсолютное содержание растительного ингредиента в сложном продукте питания, прошедшем переработку, в высшей степени затруднительно. Таким образом, несовершенство нормативной базы в Рос­сии до настоящего времени в значительной степени ограничивает область применения количественной диагностики ГМИ сырьевыми материалами и лишает смысла измерение количественного содержания ГМИ в продуктах питания.

Обнаружение и идентификация ДНК и/или белков может быть значи­тельно затруднена при исследовании прошедших глубокую переработку или очистку ингредиентов, таких как крахмал, сахар или растительные масла. Более того, ряд обработок может приводить к невозможности выявления или идентификации ГМИ в продукте. Предыдущей директивой ЕС был утвержден специальный список продуктов (в т.ч. сахар и растительные масла), которые могли быть не маркированы даже в случае, если они были изготовлены из ГМ-сырья. Настоящее законодательство ЕС обязывает производителя проводить маркировку даже в тех случаях, когда современные методы диа­гностики не позволяют определить происхождение продукта питания. Для этого введена специальная процедура учета применения ГМО на каждом из этапов - выращивания, сбора урожая, хранения, перевозки, переработки и т.д. Требования ЕС обязывают организации, имевшие отношение к про­изводству или применению ГМО, хранить соответствующую документацию

5 лет, что позволит при необходимости проследить пути распространения ГМО и выяснить потенциальные источники контаминации.

Необходимость мониторинга, качественного и количественного иссле­дования присутствия ГМО в сельскохозяйственных культурах и произве­денных из них продуктах питания обусловила потребность в аналитических методах, способных обнаруживать, идентифицировать ГМО и определять их количественное содержание в исследуемом образце. Как правило, эти методы основаны на анализе ДНК или белка, как базовых составляющих ГМО. В некоторых случаях, для определенных типов пищевых продуктов, произведенных из ГМИ, таких, как растительные масла, отличающиеся из­мененным профилем содержания жирных кислот и низким содержанием ДНК и белков, в качестве дополнительных или альтернативных методов могут быть применены хроматография или спектроскопия в ближней ин­фракрасной области.

Диагностика ГМИ должна также учитывать особенности конструирова­ния конкретных ГМО и биологическую вариабельность. Необходимы мето­ды, позволяющие различить ГМО, при создании которых были использованы одни и те же генно-инженерные конструкции, а также ГМО, несущие одну, две или более конструкций или их копий.

Сертифицированные методы, с помощью которых проводят марки­ровку ГМО-содержащих продуктов, как правило основаны на детекции специфичных фрагментов ДНК при помощи полимеразной цепной реак­ции (ПЦР) и/или детекции белка энзим-связанным иммуносорбентным методом (ELISA).

Процесс диагностики ГМИ в продуктах питания в общих чертах укла­дывается в следующую схему:

1. Скрининговая качественная диагностика. На этом этапе исследуют при­сутствие ГМИ в составе продукта питания или сельскохозяйственного сырья. Необходимо применение высокочувствительных и надежных ана­литических методов, обеспечивающих точную и надежную диагностику во всех контролирующих лабораториях, что может быть обеспечено только путем проведения межлабораторных поверок и интеркалибраций.

2. Идентификация. На этом этапе идентифицируют, какие именно ГМИ представлены в тестируемом продукте, а также разрешены ли они к применению.

3. Количественная диагностика. Результаты количественных измерений, проведенные при помощи ПЦР или ELISA, позволяют определить содер­жание ГМИ и установить, подлежит ли данный продукт обязательной маркировке, уведомляющей о присутствии ГМИ. Для четкого проведения количественных исследований желательно располагать информацией о ви­дах обработок, которым подвергался тестируемый материал, чтобы учесть прошедшую деградацию ДНК/белка и оценить точность измерений.

В настоящее время наиболее развиты и наиболее широко применяются на всех этапах диагностики методы, основанные на использовании разных видов ПЦР. Однако и другие аналитические технологии - в частности, ДНК- чипы и масс-спектрометрия, могут быть с успехом использованы для целей диагностики ГМИ.

Далее мы остановимся на наиболее важных этапах диагностики.

Отбор образцов

Этот этап во многом определяет достоверность диагностики ГМИ, осо­бенно при исследовании сложных, негомогенных продуктов. Исследуемый образец должен быть репрезентативным, т.е. в нем должны быть статисти­чески достоверно представлены все компоненты, являющиеся потенциаль­ными источниками ГМИ. Таким образом, формирование выборки должно обеспечить репрезентативность, с учетом общего объема обследуемой партии и гомогенности исследуемого материала. Масса проб должна быть достаточно большой, что позволит обеспечить надежную детекцию ГМИ на требуемом уровне чувствительности. Ожидаемые различия между образца­ми и их однородность, должна зависеть от особенностей анализируемого материала:

1. Сырьевые материалы часто недостаточно хорошо перемешаны при сборе урожая, хранении и т.д., поэтому могут содержать разнородные слои, что приводит к недостаточной достоверности исследований, проведенных на основании точечной случайно взятой пробы.

2. Ингредиенты, прошедшие переработку, имеют меньшую степень гете­рогенности, хотя разные партии одного и того же ингредиента также могут иметь различные характеристики за счет различий в используемом сырье.

3. Готовые продукты питания могут содержать ГМ-компоненты в составе одного или нескольких различных ингредиентов, так что во многих случаях можно ожидать сильной неоднородности материала.

Степень гетерогенности данного образца и фактическое пороговое зна­чение, которое устанавливается для признания присутствия ГМ - материала определяет и число отбираемых образцов, и их массу. Чем больше степень гетерогенности исследуемого материала, тем большее значение приобретает план отбора образцов. Более того, когда допустим только низкий уровень содержания ГМ-компонентов, для обеспечения репрезентативности масса образцов должна быть значительно увеличена. В случае пищевых продуктов уже существует значительный опыт работы и проверенные планы отбора образцов для решения аналогичных проблем детекции.

В Европе, также как и в США, сформулированы и утверждены требо­вания к отбору образцов для проверки на содержание ГМИ. В принятом в Швейцарии руководстве размер образца для диагностики ГМИ составляет 50 г. при тестировании соевых бобов (200 бобов), 30 г при тестировании гомогенных однородных смесей с размерами частиц не более 100 мг (мука и др.), 60 г при тестировании вязких растворов (соевый лецитин и др.).

Руководство по отбору образцов для диагностики ГМ зерна недавно опубликовано в США. Для расчета размера исследуемого образца при однократном отборе и качественном аналитическом тестировании исполь­зована формула:

log(1-(G/100))

N=-------------

log(1-(P/100))

где N- это размер образца (число зерен), G- вероятность выявления партии с определенным содержанием ГМО, Р - процент содержания ГМО в партии, при котором она должна быть отбракована. Для достижения 95% вероятности выявления партии с содержанием ГМО 1%, размер образца должен составлять 299 зерен или бобов. В этом случае «покупательский риск» получения партии с содержанием ГМО более 1% составляет 5%. Если порог определения для ГМО был установлен 0,5% с 95% вероятностью обнаружения, то размер образца должен будет составить 598 зерен. Одна­ко, при размере образца в 299 зерен вероятность отбраковки материала, содержащего более 0,5% GMO, составит около 78%. Поэтому, для того чтобы обеспечить контроль рисков и для покупателя и для продавца, были разработаны планы отбора множественных проб для качественного аналити­ческого тестирования. План отбора множественных образцов определяется (1) количеством отобранных и проверенных образцов, (2) максимальным числом положительных результатов, допустимых для данной партии зерна, и (3) количеством зерен в каждом образце. Покупатель и продавец должны согласовать три этих значения, и, таким образом, определить тот маркетин­говый риск, который они готовы принять.

Две другие опубликованные методики, относящиеся к количественному аналитическому определению доли ГМО в партии зерна, по-разному опре­деляют размер образца:

1. Рабочая группа «Генетически Модифицированные Пищевые Матери­алы» Технического Комитета CEN/TC275 Европейского Комитета по стандартизации (CEN, Брюссель, Бельгия) предполагает, что взятие образца, состоящего из 10 000 зерен приведет к относительной ошибке вследствие забора пробы менее, чем 20%, в случае, если проверяемая партия содержит 1% ГМО.

2. В работе немецких авторов (Hubneretal., 2001) показано, что в случае гомогенного материала минимум 3500 зерен должно быть проанали­зировано при расчетном содержании 1% ГМО для достижения 95% достоверности и относительной ошибке менее 20%. В случае гетеро­генного распределения частиц ГМО размер образца увеличивается до 10 000 частиц.

Такие различия в размере образцов отражают различные требования для качественного и количественного анализа ГМО.

Пробоподготовка - экстракция и очистка препарата

Так как ДНК является относительно стабильной молекулой, а методы детекции ДНК, основанные на ПЦР, очень чувствительны, именно ДНК чаще всего ис­пользуют в качестве аналита при исследовании всех типов образцов (сырье, ингредиенты, готовая пищевая продукция). В том случае, если исследуемый в лаборатории образец является репрезентативной аликвотой гомогенизи­рованного первичного образца, даже небольшого количества растительного материала (100-350 мг) достаточно для успешной экстракции ДНК. Даже в относительно чистых препаратах растительного масла, крахмала или спирта, в принципе нельзя исключить присутствия примесей исходного сырья в виде клеток или их фрагментов. Тем не менее, до сих пор не было сообщений о выде­лении ДНК в детектируемых количествах из соевого соуса и рафинированного растительного масла, также как и из рафинированного сахара и очищенного этанола, произведенного из картофеля. Оптимизация методов и использова­ние большего количества исходного материала позволили выделить ДНК из образцов нерафинированного соевого, а также рапсового масла.

Методы детекции, основанные на исследовании белков, требуют со­хранения неповрежденной третичной или четвертичной структуры, так как они основаны на иммунологических методах или на сравнении белковых паттернов при 1- или 2-мерном электрофорезе. Применение этих методов, таким образом, возможно главным образом для сырья.

Методы выделения ДНК

Эффективность метода ПЦР, как и остальных методов анализа ДНК, зависит от качества и чистоты выделенной ДНК. Качество ДНК определяется длиной фрагментов и степенью их повреждения под действием тепла, кислот и/или нуклеаз, вызывающих гидролиз, депуринизацию и/или ферментативную деградацию. Таким образом, качество препарата ДНК будет варьировать, в зависимости от исходного материала, степени его нативности и от при­меняемых методов экстракции. Необходимо иметь в виду, что ДНК, выде­ленная из прошедших переработку продуктов питания и агротехнических материалов, таких как высушенные листья табака, имеет низкое качество, так как сохранившиеся фрагменты ДНК имеют небольшой размер. Так, экс­трагируемые из соепродуктов и переработанных томатов фрагменты ДНК имеют размер всего 100-400 п.о., что необходимо учитывать при выборе праймеров для ПЦР-диагностики.

Чистота ДНК сильно зависит от присутствия различных примесей в соста­ве пищевых продуктов. В качестве примесей могут выступать вещества, вхо­дящие в состав исходного образца (полисахариды, липиды и полифенолы), или химические вещества, используемые для выделения ДНК (цетилтриме- тил аммония бромид (ЦТАБ), гексадецилтриметил аммония бромид, щелочь и т.д.). Например, Taq-полимераза, ключевой фермент ПЦР, ингибируется полисахаридами, этилендиаминтетраукусной кислотой (ЭДТА), фенолом, додецилсульфатом натрия (ДДС) и рядом других веществ.

К настоящему моменту разработано большое количество методов выделения ДНК, некоторые из которых могут с успехом применяться в диагностике ГМО. В общем, процесс экстракции ДНК должен включать следующие стадии:

1. Разрушение клеточной стенки путем измельчения замороженных в сухом льду или жидком азоте растительных тканей.

2. Разрушение клеточной мембраны при помощи детергента.

3. Инактивация эндогенных нуклеаз при помощи детергента и ЭДТА. При этом связываются ионы Mg2+, являющиеся кофакторами многих нукле­аз. В ряде случаев, особенно при использовании колонок с сорбентом, для расщепления белков добавляют протеиназу К.

4. Отделение ингибирующих полисахаридов.

5. Удаление гидрофобных компонентов, липидов и полифенолов.

6. Окончательное удаление детергента и концентрирование ДНК. (Стадии 4-6 могут быть заменены очисткой ДНК на колонке.)

Можно выделить три основных подхода к экстракции ДНК из расти­тельных тканей и продуктов питания: ЦТАБ-метод, сорбентный метод (с применением различных коммерческих наборов) и их комбинация. Хотя использование этих методов часто дает достаточно низкий выход ДНК, ка­чество и чистота получаемой ДНК выше по сравнению с другими методами, такими как щелочной метод, Chelex100 или ROSE.

ЦТАБ-метод был первоначально предложен для выделения и очистки высокомолекулярной ДНК из растительных тканей. Метод является до­статочно эффективным для широкого спектра растительных материалов и продуктов питания из них, особенно вследствие хорошего отделения полисахаридов от ДНК, и используется в протоколе детекции ГМО в соевой муке, принятом в Германии (Jankiewiczetal., 1999).

Колонки с сорбентами, связывающими ДНК, позволяют удобно выделять препараты ДНК хорошего качества. Один из коммерческих наборов использу­ется в официальном швейцарском методе детекции ГМО (SwissFoodManual, 1998). Однако в некоторых случаях полисахариды также связываются с сор­бентом колонок, что ухудшает эффективность их отделения от ДНК.

Методы анализа ДНК

Хотя в настоящее время существует значительное количество различных ме­тодов анализа ДНК, все официальные, прошедшие валидацию методы этой группы основаны именно на методе ПЦР в различных модификациях.

Метод ПЦР позволяет в миллионы раз увеличивать количество копий последовательности-мишени с высокой чувствительностью и специфичнос­тью, нарабатывая ее до легко выявляемых количеств. При этом два праймера (синтетических олигонуклеотида) ограничивают последовательность-ми­шень. Каждый праймер комплементарен либо одной, либо другой цепи в двуцепочечной ДНК. Начиная от места посадки праймера на ДНК, термос­табильная Taq-полимераза может синтезировать комплементарную копию последовательности-мишени. Благодаря этому в каждом цикле происходит удвоение ДНК-мишени. Таким образом, в последующих циклах количество последовательности-мишени должно увеличиваться в экспоненциальной пропорции, в соответствии с числом циклов.

Подтверждение идентичности конкретного ампликона является необ­ходимым шагом в процессе ПЦР-анализа, для того, чтобы быть уверенным, что ПЦР-продукт точно соответствует мишени и не является результатом неспецифического связывания праймеров. Для этой цели используется несколько методов:

1. Электрофорез в геле является самым простым методом контроля раз­мера ампликонов. Однако, существует опасность того, что может быть амплифицирован неспецифический фрагмент того же размера. Таким образом, ПЦР-продукты необходимо дополнительно проверять, напри­мер, рестрикционным анализом.

2. Другим надежным, но занимающим много времени является метод Саузерн-блот, заключающийся в том, что ампликоны разделяются электрофорезом в геле, переносятся на мембрану и гибридизуются со специфической ДНК-пробой (зондом). Этот метод может быть значи­тельно упрощен и ускорен в случае применения ДНК-чипов.

3. Гнездовая ПЦР позволяет разделить специфичные и неспецифичные продукты амплификации. При этом первичный ПЦР-продукт выступает как матрица для амплификации с использованием другой пары прай­меров, комплементарных внутреннему участку исходной последова­тельности-мишени.

4. Наиболее достоверным способом подтверждения подлинности ПЦР- продукта является определение нуклеотидной последовательности (секвенирование). Единственным недостатком этого метода является то, что немногие лаборатории имеют соответствующее оборудование. Как следует из литературных данных, лишь некоторые авторы сообщают

об использовании этого метода.

Скрининг и идентификация ГМО при помощи ПЦР

Любая стратегия детекции, основанная на методе ПЦР, требует детального знания нуклеотидной последовательности не только трансгенной ДНК, но и фланкирующих ее областей в геноме растения, так как от этого зависит подбор подходящих олигонуклеотидных праймеров.

В зависимости от выбранной мишени, ПЦР-диагностика может иметь разную специфичность. Так, если выбранные праймеры соответствуют после­довательностям регуляторных промоторных или терминаторных элементов, наиболее часто используемых при конструировании ГМО, проводимая ПЦР будет поисковой, скрининговой. В случае, если мишенью выбран структурный ген, определяющий вводимый в ГМО признак, ПЦР-диагностика позволит выявлять группу ГМО, объединенную этим признаком (т.н. устойчивостью к определенному гербициду). Если сайты узнавания праймеров локализованы в разных элементах трансгенной ДНК, например, в промоторном элементе и в структурном гене, данная диагностика будет специфически выявлять опре­деленную генноинженерную конструкцию, которая может быть использована для создания целого ряда линий ГМО (т.н. кукурузы линий Mon809 и Mon810). И, наконец, использование праймеров, один из которых соответствует после­довательности трансгенной ДНК, а другой - последовательности геномной ДН К растения, фланкирующей вставку, позволяет проводить специфическую диагностику ГМО определенной линии.

К сожалению, фирмы-разработчики ГМО как правило предоставляют только общие сведения о структуре вводимой в геном растения генно­инженерной конструкции, относя информацию о точной нуклеотидной последовательности к области коммерческой тайны. В связи с отсутствием официальной достоверной информации Институтом Контрольных Матери­алов и Методов (IRMM, Бельгия) разработано только 4 сертифицированных контрольных материала, применение которых необходимо для обеспечения достоверности проводимой диагностики ГМО.

Для целей скрининга в качестве мишеней обычно выбирают последо­вательности, характерные для как можно большей группы ГМО. Регулятор­ные элементы, такие как 35Sпромотор вируса мозаики цветной капусты (P-35S CaMV)и NOS-терминатор из Agrobacterium tumifacience (T-nos3’)а также гены резистентности к антибиотикам (т.н. ген nptll)присутствуют во многих ГМО, используемых сейчас в сельском хозяйстве. Первые методы для скрининга ГМО, разработанные в Швейцарии и Германии, основаны именно на детекции Р-35S и Т-nos3’. Однако к настоящему времени созда­но и сертифицировано к применению уже свыше 120 ГМО, в большинстве которых используются другие регуляторные элементы. P-35Sприсутствует только в 39% ГМО, Т-nos3’ - в 33%. Нельзя также забывать, что существует не менее 8 различающихся вариантов промотора Р-35S, используемых при создании ГМО. Вероятно, в дальнейшем, при создании ГМО будут избегать не только использования селективных маркеров антибиотикоустойчивости, как того требует Директива 2001/18/ЕЕС, но и последовательностей вируса мозаики цветной капусты, в том числе промотора Р-35S, так как показано, что в его состав входит последовательность, играющая в геноме роль «горя­чей точки» рекомбинации, т.е. дестабилизирующая геном. Таким образом, кроме Р-35S и Т-nos3’для гарантии полноценного скрининга необходимо использовать дополнительные последовательности-мишени. Важнейшим аспектом проблемы является выбор праймеров, позволяющих выявлять как можно большее число вариантов маркерных последовательностей ГМО. Однако надо подчеркнуть, что выявление этих маркеров позволяет только предположить присутствие в анализируемом образце ДНК ГМО, но не позволяет идентифицировать это ГМО.

Для четкой идентификации ГМО в качестве праймеров должны быть выбраны последовательности, характерные для индивидуального транс­генного организма, то есть на основе пограничного участка между сайтом интеграции и трансформируемым генетическим элементом (так называемые «краевые фрагменты») конкретной линии ГМО.

В общем случае, в качестве мишеней для диагностики ГМО не рекомен­дуется использовать последовательности, которые могут появляться в образ­це благодаря естественной контаминации - т.н. последовательности вирусов и бактерий растений, вследствие риска получения ложноположительных результатов. Образец, дающий положительный сигнал в скрининговой ПЦР на P-35S/Т-nos3’ должен быть проанализирован на присутствие собственно CaMVи A. tumefaciens,соответственно. Однако при этом следует учиты­вать, что круг хозяев, инфицируемых CaMV, ограничен крестоцветными, такими как масляничный рапс, а последовательности терминатора Т-nos3’ обнаружены только в нескольких штаммах A. tumefaciens,патогенных для определенных видов растений. В то же время, часто обнаруживаемые в почве A. tumefaciens, не вирулентны, т.е. не несут Ti-плазмиду с Т-ДНК и онкогенами. Таким образом, ген nos3’вместе с регуляторными элементами не присутствуют в этих распространенных в природе штаммах.

Еще одной стратегией идентификации ГМО является метод анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP). Этот метод применяют для установления межвидовых различий и идентификации не только растений, но и полученной из них продукции. AFLPпозволяет одно­временно проводить мониторинг присутствия ГМО и их идентификацию.

Один из вариантов AFLP, так называемый «заякоренный» (anchored)

ПЦР, может быть использован для разработки метода диагностики ГМО, специфичного для определенной линии. После рестрикционного гидролиза ДНК ГМО и последующего лигирования адаптерного олигонуклеотида к концу рестрикционного фрагмента, синтезируют адаптер-специфический праймер. ГМО-специфичные «якорные» праймеры конструируют в соответс­твии с маркерными последовательностями использованных при создании ГМО промоторов и терминаторов. В результате ПЦР с такой комбинацией праймеров возможна амплификация пограничных областей, фланкирующих трансгенную вставку. Последующее секвенирование ампликонов позволяет выявить специфичные для данной линии ГМО последовательности в области интеграции и создать праймерную систему, обеспечивающую селективную детекцию данной линии ГМО.

В целом, хотя AFLP-анализ и высокоинформативен, он обладает целым рядом недостатков, к которым можно отнести высокую сложность методики, длительность выполнения, и необходимость применения радиоактивных материалов.

Только проведением постоянного анализа всей доступной информации, относящейся к ГМО, особенно - к вводимым генетическим конструкциям и сайтам их интеграции, причем касающейся не только к ГМ растений, разре­шенных к применению, но и проходящих полевые испытания, может быть гарантирован полный и достоверный мониторинг ГМО. В странах ЕС создан и развивается регистр ГМО - база данных, содержащая значительный объем информации, необходимой для мониторинга. В то же время, результаты исследований полевых образцов генетически модифицированных расте­ний, проведенные во Франции и Бельгии в 2003 г. показали, что в ряде случаев структура и копийность трансгенных конструкций в составе расти­тельного генома отличается от заявленной организацией-разработчиком (Collonieretal., 2003). Причиной найденных расхождений может служить как нестабильность геномов ГМО, так и недостаточность исследований или недостоверность информации, предоставленной разработчиком. Таким образом, создание достоверных диагностикумов может потребовать не только изучения данных, представленных разработчиком, но и проведения независимых исследований структуры ДНК ГМО.

Применение ПЦР для количественного исследования

Главным недостатком традиционной ПЦР является невозможность получения точной количественной информации вследствие изменения в процессе ре­акции эффективности амплификации. Если бы эффективность реакции для каждого цикла амплификации оставалась постоянной, концентрация ДНК после ПЦР была бы прямо пропорциональна начальному числу ДНК-мишеней. К сожалению, этот параметр не является постоянным, особенно на поздних циклах ПЦР, когда накопление продукта идет с неизвестной скоростью, не­экспоненциально. Регистрация результатов традиционной ПЦР основана на измерениях, проведенных в конце реакции, в условиях, когда реакция вышла из экспоненциальной фазы вследствие истощения какого-либо из компонен­тов. В последнее время развиваются другие методы на основе ПЦР (количес­твенная конкурентная ПЦР (КК-ПЦР), ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР)), которые основаны на установлении связи между количеством ДНК-мишени и количеством ПЦР-продукта, образующегося в процессе амплификации.

Для определения относительного содержания ГМО в сложных пищевых смесях и продуктах оценка количества ГМ-маркера должна быть норма­лизована относительно референсного гена, специфичного для растений данного вида. На практике точное определение относительного количества может достигаться комбинацией двух абсолютных количественных реакций: одной для ГМО-специфичного гена и другой - для референсного гена. Предполагая, что ГМ материал прошел ту же обработку что и «не-ГМ ма­териал», измерения могут быть выражены в процентном соотношении как геном/геном (Г/Г) или вес/вес (В/В).

В настоящее время продолжается обсуждение вопроса, как выражать концентрацию ГМО, полученную в результате количественных исследова­ний. Хотя этот вопрос несет несколько академический характер, он имеет и практическую значимость. В лабораториях сперва измеряют концентрацию ДНК в образце, и затем эквивалентные количества ДНК используют для определения числа копий ГМО-специфичных и растение-специфичных последовательностей. Соотношение этих значений, с учетом числа копий маркерных последовательностей, определяет процентное содержание ГМО в препарате. Однако необходимо учитывать, во-первых, известные трудно­сти с точным определением концентрации ДНК. Во-вторых, соотношение Г/Г не может быть прямо пересчитано в весовые эквиваленты, поскольку различия в размере генома у разных групп растений внутри одного и того же вида может достигать 25%. Вследствие этого для количественных исследо­ваний была разработана новая группа методов, в которых количественное определение референсного гена и маркерной последовательности ГМО выполняется в одной реакционной смеси - метод мультиплексной ПЦР. В рамках этого метода соотношение копийности маркеров ГМО к числу геномов определяют без учета размера геномов и определения количества ДНК, взятого на исследование. Получаемый результат интерпретируют как отношение ГМ клеток к нативным клеткам, что в общем должно совпадать с соотношением В/В. Однако пока что признано, что наиболее корректно использование соотношения Г/Г.

Применяемые для количественных измерений аналитические стратегии могут быть разделены по двум основным используемым подходам:

1. Ко-амплификация целевого аналита и внутреннего стандарта позволяет корректировать снижение эффективности амплификации (КК-ПЦР, мультиплексная КК-ПЦР).

2. Проведение регистрации ампликонов на ранней стадии реакции, когда эф­фективность еще постоянна и концентрация продукта хорошо соответствует начальной концентрации исследуемых молекул (ПЦР-ELISA, РВ-ПЦР), КК-ПЦР заключается в ко-амплификации неизвестного количества

специфического гена-мишени и известного числа копий конкурентной

контрольной матрицы в одной и той же реакционной смеси с одной и той же парой праймеров. Небольшое различие в размере мишени и контроля (до 40 п.о.) позволяет различить продукты амплификации. Каждый образец амплифицируют в серии реакций с увеличением количества конкурентной матрицы, выдерживая постоянным концентрацию исследуемого образца. Количественная оценка достигается установлением точки эквивалентности, в которой продукты обеих реакций амплифицированы с одинаковой эффек­тивностью, что может быть установлено при анализе окрашенного геля после электрофореза. Эта реакция основана на предположении, что амплификация обеих мишеней, исследуемой последовательности и внутреннего стандарта происходит с одинаковой эффективностью в течение всей реакции, в том числе и в фазе «плато».

Метод КК-ПЦР был с успехом применен для количественного иссле­дования ГМ сои линии 40-3-2 (RoundupReady) и кукурузы Maximizer, и апробирован в межлабораторном испытании, в котором приняли участие 12 лабораторий ЕС (Studeretal., 1998). Кроме того, на основе КК-ПЦР разра­ботан метод скрининга, используемый для количественного исследования маркерных последовательностей - промотора P-35Sи терминатора Т-nos3’. Однако при использовании этого метода необходимо учитывать, что разные ГМО, и даже разные линии ГМО несут различное число копий маркерных последовательностей.

Разработан также метод двойной КК-ПЦР, позволяющий учесть ошибки, связанные с выделением ДНК из исследуемого материале. Однако вследс­твие сложности построения калибрационных кривых и зависимости точности анализа от большого количества плохо контролируемых параметров, обычно используют одну конкурентную реакцию (т.н. 1% или 5%), относительно которой можно измерить концентрацию ГМ ДНК в тестируемом образце. Таким образом, этот метод может быть использован в случаях, когда не­обходимо установить, содержится ли ГМ-материал в образце в большем или меньшем количестве, чем в калибровочном стандарте. При этом все же нельзя избежать некоторой степени неточности.

Метод ПЦР-ELISAотносится по стратегии ко второй группе и может быть использован как количественный, если ПЦР остановлена до достижения значительного снижения эффективности амплификации. Сам по себе ме­тод ELISAиспользуют для определения относительно небольших количеств ПЦР-продуктов. Несмотря на то, что относительная количественная детек­ция с использованием ПЦР-ELISAприменяется в различных областях, и что существует коммерческий набор для ПЦР-ELISA (G-Genos, Angers, France), этот метод не получил широкого признания и редко применяется для точного количественного определения ГМО.

Метод ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР), также относящейся по стра­тегии ко второй группе, значительно повышает точность, специфичность и производительность ПЦР-диагностики. Этот метод был разработан в 1992г. и быстро приобрел популярность благодаря введению полностью автомати­зированного приборного комплекса. Уникальной особенностью этого метода является возможность прямого наблюдения за амплификацией ДНК-мишени путем мониторинга образующегося продукта. Классическая реакция ПЦР адаптирована так, что амплификация диагностического фрагмента приво­дит к генерации сигнала, интенсивность которого соответствует количеству образующегося продукта. Детекция в РВ-ПЦР основана на постоянном измерении флюоресценции. Количество циклов ПЦР, необходимых для генерации сигнала, статистически достоверно превышающего «шум», счита­ется мерой количества и называется «пороговым циклом» (СО., Значение Qлогарифмически обратно пропорционально исходному количеству молекул ДНК-мишени до тех пор, пока эффективность реакции еще постоянна.

На сегодняшний день доступны различные методики для проведения мониторинга в РВ-ПЦР. При использовании ПЦР в реальном времени для детекции ГМО важно учитывать различия между специфическим и неспе­цифическим мониторингом ПЦР. Специфичность ПЦР в реальном времени зависит как от реагентов, используемых для мониторинга реакции ампли­фикации, так и от прибора, который используют для детекции сигнала. Спе­цифический мониторинг уменьшает или совсем исключает необходимость подтверждающего тестирования, так как неспецифическая амплификация в этом случае не регистрируется. Более того, этот метод может позволить проводить одновременный мониторинг нескольких специфических ПЦР (мультиплексная РВ-ПЦР, например, трансгенной ДНК и эндогенного ре- ференсного гена) в одной реакционной смеси. При неспецифичном мони­торинге, например, с использованием красителя SYBRGreenI, необходимо дополнительное подтверждающее тестирование, чтобы подтвердить, что наблюдаемый сигнал генерирует амплификация именно нужной после­довательности-мишени. Очевидно, что в случае неспецифичного метода одновременный мониторинг нескольких различных реакций невозможен.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: