Тема 2. Микробиотехнология

1. Биологические объекты биотехнологии.

2. Подбор форм микроорганизмов с заданными свойствами.

3. Методы биотехнологии.

Биологические объекты биотехнологии

Главным объектом биотехнологического процесса является клетка. В ней синтезируется целевой продукт. По сути, клетка представляет собой миниатюрный химический завод, где ежеминутно синтезируются сотни сложнейших соединений.

Основа современного биотехнологического производства - синтез различных веществ с помощью клеток микроорганизмов. Клетки высших растений и животных еще не нашли широкого применения, ввиду их высокой требовательности к условиям культивирования.

Начальным этапом биотехнологической разработкиявляется получение чистых культур клеток и тканей. Дальнейшие манипуляции с этими культурами характеризуется единообразием подходов, основанных на классических методах микробиологии. При этом культуры клеток и тканей высших растений и животных уподобляются культурам микроорганизмов.

Эукариоты и прокариоты. Большинство микроорганизмов - одноклеточные существа. Микробная клетка отделена от внешней среды клеточной стенкой, а иногда лишь цитоплазматической мембраной и содержит различные субклеточные структуры. Существует два основных типа клеточного строения, кото­рые отличаются друг от друга рядом фундаментальных признаков. Это эукариотические и прокариотические клетки. Микроорганизмов, имеющих истинное ядро, называют эукариотами (эу - от греческого - истинный, карио - ядро). Микроорганизмы с примитивным ядерным аппаратом относятся к прокариотам (до ядерным).

Среди микроорганизмов к прокариотам относятся бактерии, актиномицеты и сине-зеленые водоросли (цианобактерии), к эукариотам - прочие водоросли (зеленые, бурые, красные), микомицеты (слизевики), низшие грибы - микромицеты (включая дрожжи), простейшие (жгутиконосцы, инфузории и др.).

Их общее свойство - малые размеры, они видны лишь в микроскоп. В настоящее время известно более 100 тыс. видов различных микроорганизмов.

У прокариот не происходят процессы митоза и мейоза. Они размножаются чаще простым делением клетки.

В эукариотической клетке имеется ядро, отделенное от окружающей его цитоплазмы двухслойной ядерной мембраной с порами. В ядре находятся 1-2 ядрышка - центры синтеза рибосомальной РНК и хромосомы - основные носители наследственной информации, состоящие из ДНК и белка. При делении хромосомы распределяются между дочерними клетками в результате сложных процессов - митоза и мейоза. Цитоплазма эукариот содержит митохондрии, а у фотосинтезирующих организмов и хлоропласта. Цитоплазматическая мембрана, окружающая клетку, переходит внутри цитоплазмы в эндоплазматическую сеть; имеется также мембранная органелла - аппарат Гольджи.

Прокариотические клетки устроены проще. В них нет четкой границы между ядром и цитоплазмой, отсутствует ядерная мембрана. ДНК в этих клетках не образует структур, похожих на хромосомы эукариот. У прокариот не происходят процессы митоза и мейоза. Большинство прокариот не образует внутриклеточных органелл, ограниченных мембранами, нет митохондрий и хлоропластов.

Подбор форм микроорганизмов с заданными свойствами

Подбор необходимых для культивирования форм микроорганизмов с заданными свойствами включает несколько этапов.

2.1. Выделение микроорганизмов. Отбираются пробы из мест обитания микроорганизмов (почва, растительные остатки и т.д.). Применительно к углеводородокисляющим микроорганизмам таким местом может быть почва возле бензоколонок, винные дрожжи обильно встречаются на винограде, анаэробные целлюлозаразлагающие и метанобразующие микроорганизмы в больших количествах обитают в рубце жвачных животных.

2.2. Получение накопительных культур. Образцы вносят в жидкие питательные среды специального состава, создают благоприятные условия для развития продуцента (температура, РН, источники энергии, углерода, азота и т.д.). Для накопления продуцента холестериноксидазы используют среды с холестерином в качестве единственного источника углерода; углеводородокисляющих микроорганизмов - среды с парафинами; продуцентов протеолитических или липолитических ферментов - среды, содержащие белки или липиды.

2.3. Выделение чистых культур. На плотные питательные среды засевают образцы проб из накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии или клоны, при их пересеве получаются чистые культуры, состоящие из клеток одного вида продуцента.

Другой путь подбора микроорганизмов - из имеющихся коллекций. Например, продуцентами антибиотиков чаще являются актиномицеты, этанола - дрожжи.

Клон - культура, полученная из одной клетки, чистая культура - совокупность особей одного вида микроорганизмов, штаммы - культуры, выделенные из различных природных сред или из одной среды в разное время.

2.4. Определение способности синтезировать целевой продукт - главный критерий при отборе продуцентов. Микроорганизмы должны соответствовать следующим требованиям:

1) обладать высокой скоростью роста;

2) использовать для жизнедеятельности дешевые субстраты;

3) быть устойчивыми к заражению посторонней микрофлорой.

Одноклеточные организмы характеризуются более высокими скоростями синтетических процессов, чем высшие растения и животные. Так, корова массой 500 кг в течение одних суток синтезирует около 0,5 кг белка. Такое же количество белка за одни сутки можно получить с помощью 5 г дрожжей. Интерес представляют фотосинтезирующие микроорганизмы, использующие энергию света, способные к усвоению атмосферного азота. Выгодны термофильные микроорганизмы. Их использование снижает дополнительные затраты на стерилизацию промышленного оборудования. Скорость роста и обмен веществ у этих организмов в 1,5-2 раза выше, чем у мезофилов. Синтезирующие ими ферменты устойчивы к нагреванию, действию кислот, органических растворителей.

Методы биотехнологии

В биотехнологии выделяют 2 метода: 1) Селекция; 2) Генная инженерия. Для получения высокоактивных продуктов используют методы селекции. С помощью селекции получены промышленные штаммы микроорганизмов, синтетическая активность которых превышает активность исходных штаммов в десятки и сотни раз.

Селекция

Селекция - направленный отбор мутантов (организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение). Генеральный путь селекции - переход от простого отбора продуцентов к сознательному конструированию их геномов. На каждом из этапов из популяции микроорганизмов отбираются наиболее высокоэффективные клоны. Таким путем за длительное время были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых дрожжей, пропионовокислых бактерий и др. Применяется ступенчатый отбор: на каждом из этапов из популяции микроорганизмов отбираются наиболее высокоэффективные клоны. Ограниченность метода селекции, основанного на спонтанных мутациях, связана с их низкой частотой, что значительно затрудняет интенсификацию процесса. Изменения в структуре ДНК происходят редко. Ген должен удвоиться в среднем 106-108 раз, чтобы возникла мутация. Примером отбора наиболее продуктивных мутантов при культивировании в непрерывном режиме является отбор дрожжей по признаку устойчивости к этанолу, продукту жизнедеятельности дрожжей. К значительному ускорению селекции ведет индуцированный мутагенез - резкое увеличение частоты мутаций биообъекта при искусственном повреждении генома. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое, рентгеновское или у-излучение, некоторые химические соединения, вызывающие изменения первичной структуры ДНК. К числу наиболее известных и используемых мутагенов относятся азотистая кислота, алкилирующие агенты и т.д.

Проводят тотальную проверку (скрининг) полученных клонов. Отобрав наиболее продуктивные клоны, повторяют обработку тем же или другим мутагеном, вновь отбирают наиболее продуктивный вариант и т.д., т.е. речь идет о ступенчатом отборе по интересующему признаку.

Трудоемкость - основной недостаток метода индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора. Недостатком метода является также отсутствие сведений о характере мутаций, исследователь проводит отбор по конечному результату.

Генетическая инженерия

Генетическая инженерия – направленная модификация биообъектов в результате введения искусственно созданных генетических программ. Уровни генетической инженерии:

1) генная – прямое манипулирование рекомбинантными ДНК, включающими отдельные гены;

2) хромосомная – манипулирование с группами генов или отдельными хромосомами;

3) геномная (клеточная) – перенос всего или большей части генетического материала от одной клетки к другой (клеточная инженерия). В современном понимании генетическая инженерия включает технологию рекомбинантных ДНК.

Работа в области генетической инженерии включает 4 этапа: 1) получение нужного гена; 2) встраивание его в вектор, способный к репликации; 3) введение гена с помощью вектора в организм; 4) питание и селекция клеток, которые приобрели желаемый ген.

Генетическая инженерия высших растений осуществляется на клеточном, тканевом и организменном уровне.

Основой клеточной инженерии является гибридизация соматических клеток – слияние неполовых клеток с образованием единого целого. Слияние клеток может быть полным или с введением их отдельных частей (митохондрий, хлоропластов и т.д.).

Соматическая гибридизация позволяет скрещивать генетически отдаленные организмы. Растительные, грибные и бактериальные клетки перед слиянием освобождают от клеточной стенки и получают протопласты. Затем проводят деполяризацию наружных цитоплазматических мембран переменным электрическим или магнитным полем, используют катионы Са+. Клеточную стенку подвергают ферментативному гидролизу.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: